افزايش شكستگي DNA اسپرم انسان بعد از دو ساعت انكوباسيون

Apoptosis Will be Increased after 2h Incubation of Human Sperm at 37°C

هدف: در اين مطالعه ميزان شكستگي DNA اسپرم انساني بعد از آماده سازي به‏روش Direct swim-up در زمان‏هاي مختلف انكوباسيون به‏وسيله تكنيك TUNEL مورد ارزيابي قرار گرفت تا بهترين زمان براي انكوباسيون اسپرم‏هاي نرمال شسته شده براي استفاده در تكنيك‏هاي كمك باروري (ART) به‏دست آيد. مواد و روش‏ها: در اين مطالعه آينده نگر، 21 نمونه‏ي اسپرم نرمال مورد مطالعه قرار گرفت. از لام Makler chamber براي مطالعه تعداد و قابليت تحرك اسپرم استفاده شد. براي بررسي مورفولوژي اسپرم از رنگ آميزي پاپانيكولا و قابليت حيات اسپرم از رنگ آميزي ايوزين-نيگروزين استفاده شد. نمونه‏ها بعد از آماده سازي به‏روش Direct swim-up در زمان هاي مختلف در دماي 37 درجه سانتي‏گراد انكوبه شدند. ميزان شكستگي DNA اسپرم در فواصل زماني مختلف (3،2،1،0 ساعت) با استفاده از تكنيك TUNEL مورد ارزيابي قرار گرفت. نتايج: ميانگين درصد مورفولوژي طبيعي و حركت سريع پيشرونده اسپرم بعد از آماده سازي نسبت به قبل از آماده سازي افزايش معني‏داري 001/0 > P داشتند. درصد ميانگين قابليت حيات اسپرم بعد از آماده سازي اسپرم نسبت به قبل از آماده‏سازي به‏طور معني‏دار افزايش يافته بود (001/0 > P). درصد شكستگي DNA اسپرم در زمان دو ساعت انكوباسيون نسبت به زمان صفر (01/0 > P) و نيز زمان سه ساعت نسبت به‏زمان صفر و يك ساعت انكوباسيون (001/0 > P) به‏طور معني‏داري افزايش داشت. نتيجه گيري: انكوباسيون اسپرم نرمال در دماي 37 درجه سانتي‏گراد كه به روش Direct swim-up آماده شده براي استفاده در تكنيك‏هاي كمك باروري بايد زمان كمتر از دو ساعت باشد.

Aim: The main goal was to evaluate the impact of different incubation time intervals on human sperm DNA status using terminal deoxyribonucleotidyl transferase–mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) test. Material and methods: This prospective study involved 21 normozoospermic specimens. After direct swim-up, sperm cells were incubated at 37°C and DNA damage was evaluated at different time intervals (0, 1, 2 and 3 h). After slide fixation with methanol 100% for 4 minutes and rinse in phosphate-buffered solution (PBS), TUNEL was added to each slide and incubated for 60 minute in dark. Eosin-Nigrosin and Papanicolaou staining protocols were applied in order to assess sperm viability and morphology, respectively. Results: Sperm viability and normal morphology was improved after sperm processing (100%, 72.3% respectively, p < 0.0001). The rate of DNA damage was significantly higher after 2h compared to 0h (9.19±0.8% Vs 4.9±0.9%, respectively, p=0.008). Also there was significant difference in abnormal sperm DNA between 3h and 1h (10.95±0.7% Vs 7.1±1%, respectively, p=0.020). Conclusion: Incubation of prepared normozoospermic samples at 37°C more than 2 h may be associated with sperm DNA fragmentation. Therefore, it seems that incubation of human spermatozoa at 37°C should be limited up to 2h prior to use in ART clinics. Keywords: Spermatozoa, DNA fragmentation, TUNEL