همسانه سازي ژن فيوژن پروتيين ويروس بيماري نيوكاسل در شاتل وكتور بكميدي مشتق از باكيولوويروس به منظور بيان در لاين سلولي حشره

Cloning of fusion protein gene of Newcastle disease virus into a baculovirus derived bacmid shuttle vector, in order to express it in insect cell line

زمينه و هدف: ويروس بيماري نيوكاسل (New Castle disease Virus) از مهم‌ترين عوامل بيماري‌زا در طيور است و واكسيناسيون هم‌چنان به عنوان راهكاري موثر براي كنترل اين بيماري مطرح است. فيوژن پروتيين (F) قرار گرفته روي سطح ويروس بيماري نيوكاسل، در بيماري‌زايي اين ويروس نقش اساسي دارد و مي‌تواند به تنهايي باعث القا ايمني محافظتي گردد. با اين پيش زمينه، هدف ما، توليد يك سازه نوتركيب (كد كننده پروتيين F) از شاتل وكتور بكميدي مشتق از باكيولوويروس به منظور بيان آن در لاين سلولي حشره بود. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه تجربي، ابتدا ژن كامل F از سويه غير بيماري‌زاي لاسوتا ويروس بيماري نيوكاسل، به منظور توليد رشته DNA مكمل (cDNA)، با تكنيك RT-PCR فراوان سازي گرديد. محصول تكثير، در وكتور كلونينگ A/T و سپس در پلاسميد دهنده pFastBac Dual همسانه سازي گرديد. بعد از تاييد فرآيند كلونينگ با دو روش PCR و آناليز هضم آنزيمي، صحت توالي با روش تعيين توالي تاييد شد. در نهايت بكميد نوتركيب واجد ژن F متعاقباً در سويه باكتريايي Bac10DH توليد و سازه فوق با يك پنل اختصاصي PCR با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي ژن F و پرايمرهاي عمومي 13M مورد تاييد قرار گرفت. يافته‌ها: تحليل تست‌هاي تاييدي نشان داد كه سازه نوتركيب بكميدي- بيان كننده ژن پروتيين F با توالي و چارچوب صحيح- با موفقيت ساخته شده است. نتيجه‌گيري: محصول اين سازه نوتركيب واجد ژن F علاوه بر كاربرد مستقل در القا ايمني محافظتي مي‌تواند به همراه محصول ديگر باكيولوويروس‌هاي نوتركيب- بيان كننده ژن‌هاي HN و NP براي توليد ذره شبه ويروسي (virus-Like particle,VLP) ويروس فوق در لاين سلولي حشره- مورد استفاده قرار گيرد.

Background: Newcastle disease virus (NDV) is one of the major pathogens in poultry and vaccination is intended to control the disease, as an effective solution, yet. Fusion protein (F) on surface of NDV, has a fundamental role in virus pathogenicity and can induce protective immunity, alone. With this background, here our aim was to construct a baculovirus derived recombinant bacmid shuttle vector (encoding F-protein) in order to express it in insect cell line. Materials and Methods: In this experimental study, at first complete F gene from avirulent strain La Sota of NDV was amplified by RT-PCR to produce F cDNA. The amplicon was cloned into T/A cloning vector and afterwards into pFastBac Dual donor plasmid. After the verification of cloning process by two methods, PCR and enzymatic digestion analysis, the accuracy of F gene sequence was confirmed by sequencing. Finally, F-containing recombinant bacmid was subsequently generated in DH10Bac cell and the construct production was confirmed by a special PCR panel, using F specific primers and M13 universal primers. Results: Analysis of confirmatory tests showed that the recombinant bacmid, expressing of F-protein gene in correct sequence and framework, has been constructed successfully. Conclusion: The product of this F-containing recombinant bacmid, in addition to its independent application in the induction of protective immunity, can be used with the other individual recombinant baculoviruses, expressing HN and NP genes to produce NDV-VLPs in insect cell line.