تاثير Chitosan بر ويژگي‌هاي استيوژنيك سلول‌هاي بنيادي مزانشيمال پالپ دندان شيري

Effect of chitosan on osteogenic properties of mesenchymal stem cell of exfoliated deciduous teeth

زمينه و هدف: پالپ دندان‌های شيری اكسفوليه شده، حاوی سلول‌های بنيادی با قابليت تكثير و كلونی‌زايی بالا می‌باشد. اين سلول‌ها توانايی تمايز به رده‌های مختلف سلولی نظير استئوبلاست، آديپوسيت، كندروسيت و سلول‌های عصبی را دارند. اين مطالعه با هدف ارزيابی تمايز سلول‌های بنيادی مزانشيمال جدا شده از پالپ دندان شيری به استئوبلاست و بررسی تاثير گلوكزآمين در فرم Chitosan بر اين تمايز، انجام شد. روش بررسی: پالپ دندان‌های شيری لق، كه سالم و عاری از پوسيدگی بودند، بلافاصله پس از كشيدن دندان، خارج شده و در محلول هضم آنزيمی ‌حاوی كلاژناز نوع 1 و ديسپاز غوطه‌ور شد. سپس در محيط كشت α Modified Eagle Medium (α MEM) محتوی 10 درصد Fetal Bovine Serum (FBS) كشت داده شدند. پس از سه هفته تشكيل كلونی توسط سلول‌ها ارزيابی شد. بررسی فلوسيتومتريك برای شناسايی ماركرهای سطحی سلول‌های بنيادی در روز 21 انجام گرفت. سلول‌های سومين پاساژ سلولی، جهت تمايز استئوژنيك در محيط كشت روتين و محيط كشت حاوی 10 ميكروگرم در ليتر Chitosan، كشت داده شدند. ارزيابی تمايز استئوژنيك در روز 21 با اندازه‌گيری فعاليت آلكالين فسفاتاز و تعيين ميزان تشكيل ندول‌های مينراليزه با رنگ‌آميزی Alizarin red انجام شد. نتايج حاصل به روش T-test آناليز شد. برای بررسی نرمال بودن توزيع داده‌ها از آزمون غير پارامتری Kolmogrov- Smirnov استفاده شد. يافته‌ها: كلونی‌زايی بيش از 80% در سلول‌های مورد بررسی ديده شد. آناليز نتايج فلوسيتومتری نشان داد كه در سلول‌های جدا شده از پالپ دندان شيری ماركرهای مزانشيمال CD90, CD105, CD146 مثبت بودند. درحاليكه ماركرهای هماتوپوئتيك CD45, CD34 و ماركرسلول‌های اندوتليال CD31 در آن‌ها يافت نشد. تشكيل ندول مينراليزه و فعاليت آلكالين فسفاتاز در حضور گلوكزآمين به طور معنی‌داری بيشتر بود )001/0(P<. نتيجه‌گيری: سلول‌های بنيادی از پالپ دندان شيری اكسفوليه شده استخراج و كشت داده شد. اين سلول‌ها توانايی تمايز استئوژنيك دارند و افزودن گلوكزآمين (Chitosan) به ميزان 10 ميكروگرم در ليتر تاثير مثبتی در اين تمايز دارد.

Background and Aims: The exfoliated human deciduous tooth contains multipotent stem cells [Stem Cell from Human Exfoliated Deciduous tooth (SHED)] that identified to be a population of highly proliferative and clonogenic. These cells are capable of differentiating into a variety of cell types including osteoblast/osteocyte, adiopcyte, chondrocyte and neural cell. The aim of this study was to evaluate the differentiation of SHED to osteoblast in standard osteogenic medium and comparing the results with medium which supplemented with glucosamine in form of chitosan. Materials and Methods: Dental pulp cells were isolated from freshly extracted primary teeth, digested with 4 mg/ml collogenase/dispase, and grown in Dulbeccoʹs modified Eagleʹs medium with 10 percent fetal bovine serum. The clonogenic potential of cells was performed after 3 weeks of culture. Flowcytometric analysis, performed at day 21 of culture to identify surface markers of mesenchymal stem cells. The cells from 3rd passage were used for osteogenic differentiation in routine osteoinductive medium. Chitosan (10 μg/ml) was added to the culture medium of case group. Alizarin Red Staining and Alkaline Phosphatase (ALP) activity were done to evaluate osteogenic differentiation in the developing adherent layer on the third passage. The results were analyzed using T-test. For the analysis of normal distribution of data, non-parametric Kolmogrov-Smirnov test was used. Results: The colonogenic efficiency was more than 80%. Flowcytometric analysis showed that the expression of mesenchymal stem cell marker CD90, CD105 and CD146 were positive in SHED, while hematopoietic cell marker CD34, CD45 and endothelial cell marker CD31 were negative. Quantitative analysis of Alizarin Red Staining demonstrated that: mineralized nodule formation was higher in the group supplemented with glucosamine (chitosan). Results from Alkaline Phosphatase activity test, on day 21, demonstrated a significantly higher ALP activity in the group supplemented chitosan (P<0.001). Conclusion: Stem cells isolated and cultured from exfoliated deciduous teeth pulp can be differentiated to osteoblast. Addition of chitosan can be beneficial to promote osteogenic differentiation of these cells.