دورگه سازي در محل بر روي جنين جوجه

Whole-mount In situ Hybridization in chick embryo

سابقه و هدف: تكنيك دورگه سازي در محل بر روي جنين (wmISH) يكي از ابزار هاي قدرتمند در بررسي جايگاه بيان رونوشت ژن در بافت هاي جنيني است. اين مطالعه با هدف راه اندازي اين تكنيك با استفاده از كاوشگر ضد الگوي آنزيم RALDH2 كه با ديگوكسي ژنين نشاندار شده بود انجام شد. مواد و روش ها: پس از جداسازي جنين جوجه در مراحل ابتدايي تكوين، آنها فيكس و آبگيري شدند و پس از بيرنگ شدن و تاثير پروتيين كيناز K بر آنها ابتدا محلول دورگه سازي و بعد محلول دورگه سازي حاوي كاوشگر ضد الگوي آنزيم RALDH2 به مدت 36 ساعت بر آنها تاثير داده شد. در نهايت پس از شستشو با محلول SSC و انكوبه شدن با آنتي بادي ضد ديگوكسي ژنين به آنها محلول NBT/BCIP افزوده شد و جنين ها به محيط بافري NTMT منتقل شدند. به دسته از جنين ها كاوشگر الگوي اين آنزيم اضافه شد و به جنين هاي كنترل منفي نيز هيچ گونه كاوشگري افزوده نشد. يافته ها: پس از گذشت 36 ساعت به دنبال اتصال كاوشگر ضد الگوي آنزيم RALDH2 به رونوشت هاي اين آنزيم در سومايت هاي جنيني و نيز لوله هاي عصبي و قلبي جنين جايگاه حضور اين رونوشت ها در بافت هاي مذكور به رنگ آبي مشاهده شدند. در گروه هايي كه كاوش گر الگو اضافه شده بود و نيز گروه كنترل منفي سومايت ها و بافت عصبي رنگ نگرقته بودند. ننتيجه گيري: با استفاده از تكنيك wmISH مي توان ارزيابي دقيقي از مكان و ميزان بيان رونوشت ژن ها در جنين به دست آورد.

Background & Aim: whole-mount in situ hybridization (wmISH) is a powerful tool to visualize the gene transcript in embryonic tissue. This study aimed at setting up wmISH by using digoxygenine-labled RALDH2 antisense riboprobe. Methods & Materials: The early developing chick embryos were fixed and dehydrated upon dissecting. Following bleaching and protein kinase K treatment, the embryos were hybridized with hybridization buffer and then with the buffer containing RALDH2 antisense riboprobe for 36h. Upon washing with SSC solution and incubation with anti-digoxygenin Ab, the embryos were treated with NBT/BCIP and transferred to NTMT buffer. Some embryos received sense ribobrobe and negative control was considered as a group that did not treat with any riboprobes. Results: Following binding the antisense riboprobe to RALDH2 transcript, blue color appeared in somites and neural tube as well as the cardiac tube. No color was detected in the embryonic tissue treated with the sense riboprobe or in untreated group. Conclusion: Using wmISH, we can precisely detect location and rate of the gene transcription in the developing embryo