بررسي حساسيت روش Real - time PCR براي تشخيص ويروس بيماري نيوكاسل

Assessment of the sensitivity of Real-time PCR for diagnosis of Newcastle disease virus

بيماري نيوكاسل يكي از مخرب‌ترين بيماري‌هاي ويروسي طيور در سرتاسر جهان است. باتوجه به اينكه روش‌هاي سنتي قابليت محدودي در كنترل اين بيماري دارند، هدف از انجام اين مطالعه استفاده از تكنولوژي‌هاي نوين براي تشخيص به موقع بيماري جهت كاهش خسارت پيش روي صنعت طيور مي‌باشد. در اين مطالعه به منظور تشخيص ويروس نيوكاسل، يك روش Real-time-PCR بهينه سازي گرديد. استخراج RNA با استفاده از كيت RNease mini (شركت كياژن، آمريكا) و بر اساس دستورالعمل شركت سازنده استخراج شد. RNA استخراج شده با 109×23/68 رونوشت اوليه به صورت سري رقت‌هاي μl 100 براي انجام واكنش Real-time PCR تهيه شد. در اين آزمايش از سويه B1 واكسن ويروس استفاده شد. آزمايش Real-time-PCR با استفاده از كيت تجاري ساخت شركت Genekam Biotechnology كشور آلمان انجام شد. حساسيت واكنش Real-time PCR با توجه به سري رقت‌هاي تهيه شده 34-10×1 رونوشت/ميكروليتر تعيين گرديد. با توجه به اينكه سرعت و دقت تشخيص ويروس نيوكاسل در همه‌گيري‌ها، نقش مهمي در كنترل بيماري دارد. استفاده از اين روش به عنوان يك روش تشخيصي با حساسيت بالا توصيه مي‌گردد.

Newcastle disease is one of the most serious viral diseases in the poultry worldwide. Since the traditional strategies have been not control it well, the aim of this study was to introduce new methods for early and rapid diagnosis of Newcastle. In this study, to detect the virus, a Real-time PCR method was optimized,Viral RNA was extracted from strain B1 using the kit RNease mini (Qiagen, USA), according to the manufacturerʹs instructions. This sample had 68.23×109copy numbers of viral RNA per each microliter. Then, a serial dilution as 100-fold was prepare from the initial sample. Then, these dilutions were simultaneously applied in reverse transcription and Realtime PCR using commercial kits (Genekam Biotechnology, Germany) according to the manufacture’s instruction. The sensitivity of Real-time PCR reaction was determined based on serial dilutions of 1×10-34 copy number per micro liter. Since, speed and accuracy in diagnosis of contagious of Newcastle disease virus plays an important role to control the disease, so adopting this method is recommended as a diagnostic test with high sensitivity.