تثبيت آنزيم ارگانوفسفر هيدرولاز بر سطح اسپور باكتري باسيلوس سوبتيليس به روش جذب سطحي

Immobilization of Organophosphorus Hydrolase on the Surface of Bacillus subtilis Spores by the Adsorption Method

تركيبات ارگانوفسفره به وفور در آفت‌كش‌ها و عوامل عصبي شيميايي استفاده شده‌است. آنزيم ارگانوفسفر هيدرولاز يك پروتيين همودايمر است كه اولين بار از باكتري سودوموناس ديمينوتا و فلاوباكتريوم جدا شده است. اين آنزيم قادر به تجزيه گستره وسيعي از تركيبات ارگانوفسفره سمي است. استفاده از فرم تثبيت شده اين آنزيم در مقابل فرم آزاد آن باعث افزايش پايداري آنزيم مي شود و قيمت آن را به‌واسطه امكان بازيافت و استفاده مجدد از آن كاهش مي‌دهد. همچنين با تثبيت آنزيم امكان جداسازي آسان و سريع آن از محيط واكنش نيز فراهم مي‌شود. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه ژن كد كننده آنزيم نوتركيب ارگانوفسفر هيدرولاز در ناقل بياني (+)26b -pET كلون شد و در ميزبان اشرشياكلي(E. coli)BL21 (DE3) pLysS بيان و به داخل محيط كشت باكتري ترشح شد. سپس آنزيم خالص‌سازي و براي اولين بار روي سطح اسپور باكتري باسيلوس سوبتيليس به روش جذب سطحي تثبيت شد. نتايج: نتايج اين مطالعه نشان داد كه تقريباً حدود 42 تا 45 درصد فعاليت آنزيم ارگانوفسفر هيدرولاز در ارتباط با اسپور‌ها مشاهده شد و در pH و دماي بهينه فعاليت آنزيم با جذب روي اسپور تغييري حاصل نشد اما پايداري آنزيم متصل به اسپور در دما و pH‌هاي بالا بيشتر از فرم آزاد آنزيم بود. نتيجه‌گيري: با توجه به امنيت اسپور باكتري باسيلوس سوبتيليس براي انسان و محيط زيست از اين سيستم مي‌توان به‌عنوان يك تجزيه‌گر زيستي دوستدار محيط زيست براي تجزيه تركيبات ارگانوفسفره با كارآيي بالا استفاده نمود.

Organophosphorus (OPs) compounds are widely used in many pesticides, insecticides and chemical nerve agents. These compounds are hazardous for humans and the environment. Organophosphate hydrolase (OPH) is a homodimeric protein initially isolated from Pseudomonas diminuta MG and Flavobacterium species. This enzyme is able to degrade a broad spectrum of toxic OPs compounds. Using immobilized OPH commonly presents a variety of advantages versus the free form of the enzyme. Advantages include an increase in stability, cost reduction by simple recovery and reutilization of the enzyme, quick and easy separation of the reactant and product in the reaction medium. Methods: Plasmid pET-26b (+) was used to generate the OPH protein under the control of the T7lac promoter. E. coli BL21 (DE3) pLysS was used as the host for expression of the OPH enzyme. Recombinant OPH was secreted into the extracellular medium and the purified enzyme was immobilized on the surface of Bacillus subtilis spores by the adsorption method, for the first time. Results: Approximately 42% to 45% enzymatic activity was determined to be associated with spores. Optimal pH and temperature of the enzyme were not altered by the presence of the spores. Thermo and pH stabilities of the immobilized enzyme was higher than the free form of the enzyme. Conclusion: Bacillus subtilis spores are safe for humans and the environment. Therefore this system can be considered an environmentally friendly biocatalyst for degradation of OPs