بهينه سازي تراريختي در گياه كلزا (B.napus L. ) با كنترل توليد گاز اتيلن وافزايش تدريجي عامل انتخاب كننده

Optimization of transformation in canola (B.napus L.) with control of ethylene production and gradual increase in concentration of selection element

كلزا (Brassica napus L.) يكي از مهم ترين گياهان روغني جهان به شمار مي رود. علي رغم توليد گياهان تراريخته كلزا كارآيي انتقال به اين گياه پايين مي باشد. با توجه به اهميت تاثير ژنوتيپ گياه و تركيب محيط كشت بر تراريختي و باززايي و همچنين سميت كانامايسين براي رشد اين گياه، توسعه يك روش مناسب جهت انتقال ژن بسيار ضروري است. در اين پژوهش از ريزنمونه هاي برگهاي لپه اي با استفاده از آگروباكتريوم تومي فاشينس سويه هاي حاوي ژن EPSPS براي تراريخت نمودن رقم7045-91 PF استفاده شد. ريز نمونه ها پس از تلقيح با اگروباكتريوم محيطهاي مختلف همكشتي ، دماي 25 درجه سانتي گراد و تاريكي قرارداده شد. طي باززايي به منظور جلوگيري از نكروز شدن ريز نمونه ها و گزينش موثر از نيترات نقره به عنوان ممانعت كننده توليد اتيلن و افزايش پلكاني غلظت كانامايسين به عنوان ماده انتخاب كننده استفاده شد. براي اين منظور ابتدا ريزنمونه ها در محيط باززايي حاوي نيترات نقره و بدون حضور كانامايسين نگهداري شدند. پس از آن با حفظ غلظت ثابتي از نيترات نقره (5 ميلي گرم بر ليتر)، كانامايسين در يك فاصله 10 روزه به غلظت 15ميلي گرم بر ليتر افزايش داده شد. نوساقه هاي باززا شده به منظور القاي ريشه زايي به محيط پايه MS حاوي 15گرم بر ليتر ساكارز و غلظت 2/0 ميلي گرم بر ليتر از IBA منتقل شدند. انتقال موثر ژن به گياهان با آزمونهاي مولكولي تاييد شد. در اين بررسي مشخص شد كه با افزايش تدريجي عامل انتخابي، درصد تراريختي نيز افزايش مي يابد.

Canola (Brassica napus L.) is one of the most important oil producing plants in the world. In recent years, in spite of transformation in canola via Agrobacterium, the efficiency of this method is still low. To consider the effect of plant genotype and cultivation medium composition on transformation and regeneration in canola and the high toxicity of kanamycin for growth of this plant, it is necessary to develop more appropriate and efficient method for transformation of this oily plant. Here we used cotyledon explants and Agrobacterium tumefaciens strains LBA4404, GV3850, GV3101 harboring mutated gene EPSPS (pBI121+EPSPS) for transformation of canola PF7045-91 cultivar. After induction with agrobacterium, explants were placed in different cocultivation medium under dark condition at 25 degree centigrade. In regeneration process, to prevent necrosis of explants, the fixed amount of silver nitrate (5mg/L) was used for blocking ethylene production. The regeneration and selection procedure were started in medium containing silver nitrate without kanamycin and this carried on for one week. Subsequently, the kanamycin was added (5 mg/L) and its concentration was increased up to 15 mg/L in a ten days period. For root induction, the regenerated shoots were transferred to medium containing the MS salt with 15 g/L sucrose and 0.2 mg/L IBA. Transformation was confirmed by molecular analysis. Our data showed that gradually increasing kanamycin concentration and blocking ethylene production could improve the transformation of B. napus.