بهينه سازي تراآلايي و بيان پايدار فاكتور9 انساني در رده سلولي دروزوفيلا

Optimization of transfection and stable expression of human factor IX in Drosophila S2 cells

با هدف دستيابي به كلونهاي پايدار از رده سلولي S2 از دروزوفيلا بيان كننده فاكتور 9 انعقادي انساني (S2-hFIX)، در اين مطالعه تاثير عوامل مختلف بر تراآلايي (Transfection) و بيان پروتيين نوتركيب در سامانه بياني S2 قابل القا ، با استفاده از يون فلزي به عنوان القا كننده، مورد ارزيابي قرار گرفت. پس از تراآلايي يك سازه بيان كننده EGFP تحت كنترل پروموتر متالوتيونين (pMT-EGFP) به سلولهاي S2 با روشهاي ليپوفكشن و كلسيم فسفات، بررسي نتايج بياني نشان داد كه انتقال سازه به اين سلولها با روش كلسيم فسفات در06/7pH= و غلظت µg/ml 10 كارآيي بالاتري دارد. الگوي الكتروفورزي محصولات RT-PCR فاكتور 9 ترشح شده از سلولهاي S2-hFIX نشان داد كه پروموتر متالوتيونين دروزوفيلايي به دنبال القا با سولفات مس از دقت تنظيمي بالايي برخوردار است و قادر به هدايت نسخه برداري در سطح بالا است. جداسازي كلون پايدار در دو محيط واجد ميتوميسين (روش غير مستقيم) و فاقد آن (روش مستقيم) مورد مقايسه قرار گرفت كه در هر دو روش زمان تهيه كلون پايدار حدود 3 هفته است كه نسبت به زمان تهيه كلون پايدار در سلولهاي پستانداران بسيار كوتاه تر است.

Our data point to optimized experimental conditions for high expression of heterologous proteins by Drososphila melanogaster S2 cells. Following construction of pMT-EGFP and transfection of S2 cells with calcium phosphate or lipofection methods, the EGFP expression analysis showed that the transfection efficiency with calcium phosphate method with pH=7.06 and 10 ?g/ml of DNA is more than lipofection method. The electrophoresis pattern of the RT-PCR products of S2 driven hFIX indicated that the Drosophila metallothionein promoter is tightly regulated and capable of driving high-level heterologous transcription upon induction by CuSO4. Nevertheless, the two methods were designed for construction of a recombinant stable S2 cell. In both methods, with and without Mitomycin, stable clones were recovered after only 3 weeks of hygromycin selection that is shorter than selection time in the mammalian cells. Therefore, our results show that Drosophila S2 cells do not have the limitations mentioned for mammalian cells.