جهش زايي هدايت يافته مكاني به منظور توليد پروتيين جهش يافته Iranian rice-NSLTP2 (Oriza sativa) حاوي جهش Y45W

Site directed mutagenesis to produce mutant Iranian rice-NSLTP2 (Oriza sativa) protein that contains Y45Wmutation

NSLTP (nonspecific lipid transfer protein) ها پروتيينهاي گياهي هستند كه بر اساس وزن مولكولي به دو گروه nsLTP1 و nsLTP2 تقسيم بندي مي ‌شوند. اين پروتيينها بسيار مقاومند و علاوه بر پتانسيل حمل داروها مي ‌توانند آنها را در برابر اكسيداسيون يا تجزيه شدن محافظت كنند. nsLTP2 برنج پروتييني است كه به دليل توانايي ذاتي عبور از غشا و اتصال به تركيبات استروييدي (از جمله برخي تركيبات دارويي) پتانسيل استفاده در سيستمهاي تحويل دارو را دارد. در اين تحقيق با هدف افزايش خاصيت فلورسانس در ژن Iranian rice nsltp2 ( Oriza sativa)، جهشهاي هدايت يافته مكاني ايجاد گرديد. براي ايجاد جهش از تكنيك SOE-PCR (splicing by overlap extension-polymerase chain reaction) در تبديل اسيدآمينه تيروزين 45 به تريپتوفان (Y45W) ژن nsLTP2 استفاده شد. مطالعات انجام شده بر روي ساير گونه هاي اين پروتيين حاكي از افزايش خاصيت فلورسانس در اثر ايجاد اين نوع جهش است. در مرحله بعد با تكثير قطعات جهش يافته و تاييد جهش ايجاد شده توسط توالي يابي، محصول جهش يافته در وكتور pET32-a كلون و پس از بيان در سويه بياني BL21(DE3)pLYSs، پروتيين تغيير يافته حاويHis-tag ، تخليص و وجود پروتيين با استفاده از وسترن بلات تاييد گرديد. اميد مي ‌رود از اين پروتيين بتوان به عنوان يك انتقال دهنده دارويي به خصوص داروهاي درمان سرطان استفاده شود.

NsLTPs (nonspecific lipid transfer proteins) are plant proteins subdivided into nsLTP1(9kDa) and nsLTP2 (7kDa) according to the molecular weight. These highly stable proteins can protect drugs against oxidation or degradations. Rice nsLTP2 due to the inherent ability to cross biological membranes and bind to steroid compounds (including some pharmaceutical compounds) have potential application for use in drug delivery systems. To enhance the biological capability of this protein in this system, structural alterations are indispensable. These alterations can be created by desired mutations in the encoding genes. Analysis by different software showed that the hydrophobic cavity of the active site plays a prominent role. After designing of mutagenic primers (Tyrosine 45 to Tryptophan (Y45W)) the method of SOE-PCR was used to perform site directed mutagenesis in the gene of rice nsLTP2. Wild type nsLTP2 was cloned into the PGEX6p2 vector. This wild type plasmid was used as a template for constructing the mutant fragment and designed mutant primers are used for amplification of mutant fragments. Mutant rice nsLTP2 are expressed in the pET32a vector in to the Ecoli BL21 (DE3) strain. After the amplification of the mutant fragments and confirmation of mutations generated by sequencing, the mutant constructs cloned into the pET32a vector and the fusion mutant protein with a His-tag was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The purpose was to create mutations with increased florescence signals. We hope that, in the future, these findings would be helpful in creating biosensors or as drug carrier vehicles.