خالص سازي وتعيين خصوصيات كينتيكي آنزيم آسپاراژيناز در باكتري Serratia marcescens

Purification and determination of kinetics parameters of asparaginase from Serratia marcescens

آسپاراژيناز يك آنزيم هيدرولاز مي باشد كه آسپاراژين را به آمونيوم و آسپارتيت تبديل مي كند. اين آنزيم كاربرد موثري در درمان لوسمي لنفوبلاستيك دارد. marcescens Serratia يك باكتري گرم منفي است كه كلنيهاي آن داراي رنگيزه قرمز مي باشند كه مي تواند در صورت حضور آسپاراژين در محيط كشت خود، توليد آنزيم آسپاراژيناز نمايد. در اين تحقيق آنزيم آسپاراژيناز از محيط كشت Serratia خالص سازي و همچنين فاكتور هاي كينتيكي آن تعيين شد. باكتري Serratia در محيط مايع حاوي پپتون، عصاره مالت و آسپاراژين كشت شد و محيط بعد از 44 ساعت سانتريفيوژ شد و محلول رويي كه داراي آنزيم آسپاراژيناز بود براي مطالعات كينتيكي و خالص سازي مورد استفاده قرار گرفت. مراحل تخليص آنزيم با استفاده از رسوب دهي با آمونيوم سولفات و به دنبال آن دياليز و ستون كروماتوگرافي DEAE سلولز انجام شد. انجام الكتروفورز به روش SDS-PAGE باندي با وزن مولكولي تقريبي حدودkDa 54 را بر روي ژل نشان داد كه نشان دهنده خلوص آنزيم بود. مقايسه تاثير تغييرات pH (10-4) بر فعاليت آنزيم نشان داد كه بيشترين فعاليت آنزيم در 7 pH است، و بررسي تغييرات دما بر فعاليت آنزيم نشان داد كه بيشترين فعاليت در دماي 40 درجه سانتي گراد مي باشد. همچنين مقدار فاكتور هاي كينتيكي Vmax و Km در اين آنزيم مشخص گرديد.

Asparaginase is a hydrolytic enzyme that catalyses asparagine to aspartic acid and ammonia. The enzyme is used for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL), lymphoma and melanolymphoma. S. marcescens is a Gram-negative bacterium with red pigment that can produce asparaginase in culture medium culture in the presence of asparagine. In this study asparaginase was purified and kinetic parameters of enzyme were determined. A modified culture medium was used for enzyme production containing malt extract, soy peptone and asparagine. Enzyme activity was detected after 8 hours and maximum enzyme activity was reached after 40-44 hours of incubation. Purification of the enzyme was carried out using ammonium sulfate precipitation. The concentrated enzyme preparation was loaded onto DEAE cellulose chromatography column. The SDS-PAGE was determined a single band with about 54 kDa protein. The optimum pH and temperature of enzyme activity were determined to be about 7 and 40?C respectively, and the kinetic parameters such as Km and Vmax were measured for the first time in this study.