بيان هترولوگ آنزيم كيتيناز 36 كيلو دالتوني از قارچ Trichoderma atroviride در ميزبان پروكاريوتي

Chitinolytic enzymes are involved to break down chitin waste products such as chitin shells of crustaceans and cell walls of fungi and production of chitin oligosaccharides. Ideal catalytic properties

آنزيمهاي كيتينوليتيك در تجزيه پسماندهاي كيتيني نظير پوسته سخت‌پوستان و ديواره سلولي قارچها و توليد اليگوساكاريدها از كيتين نقش دارند. خصوصيات كاتاليتيك آنها، اين آنزيمها را هدف مناسبي جهت استفاده درصنعت يا به عنوان بيوكنترل قرار داده‌ است. در اين مطالعه جهت تكثير و همسانه‌سازي ژن chit36 از جدايه بومي ايران Trichoderma atroviride PTCC5220، آغازگرهاي اختصاصي (chit36pf/chi36r) طراحي و پس از تكثير قطعه مورد نظر، به منظور توليد پري‌پلاسمي در وكتور pET26b(+) همسانه‌سازي و جهت بيان به باكتري E. coli BL21-DE3 انتقال داده شد. در بررسي نتايج حاصل از SDS-PAGE هيچ گونه باندي دال بر بيان پروتيين در هيچكدام از شرايط دمايي و ميزان متفاوت IPTG در بخشهاي متفاوت سلولي مشاهده نشد. لذا در ادامه، بيان پروتيين Chit36 با حذف پپتيد نشانه pelB (جهت توليد به صورت سيتوپلاسمي) همراه با توالي هيستيدين در انتهاي كربوكسيلي دردستور كار قرارگرفت. باكتري حاوي سازه نوتركيب تحت شرايط القايي متفاوت مورد بررسي قرار گرفت. عليرغم عدم مشاهده هيچ گونه باندي در هيچكدام از شرايط القايي با روش SDS-PAGE، بيان اندك پروتيين در 2 كلني با استفاده از روش Western blot مورد تاييد قرار گرفت. به منظور بهينه سازي شرايط بيان، ميزان بيان پروتيين نوتركيب نسبت به پروتيين تام باكتري درشرايط متفاوت القايي، به روش سنجش كمي باند هاي پروتييني روي ژل SDS-PAGE مورد ارزيابي قرار گرفت. نتايج حاصله نشان داد كه بهترين شرايط بيان در زمان القا OD600 : 0.3 و ميزان IPTG يك ميلي‌مولار و زمان انكوباسيون 6 ساعت مي‌باشد، دراين شرايط ميزان بيان پروتيين نوتركيب نسبت به پروتيين تام برابر 57/45 درصد مي‌باشد.

Chitinolytic enzymes are involved to break down chitin waste products such as chitin shells of crustaceans and cell walls of fungi and production of chitin oligosaccharides. Ideal catalytic properties of these enzymes make them an attractive target for use in industry or as a biocontrol. In this study to amplify and cloning of chit36gene from native Iranian isolate, Trichoderma atroviride PTCC5220, Specific primers (chit36pf/chi36r) were designed and then intended to produce in periplasmic form, amplified fragment was cloned into pET26b(+) vector. The new construct was transformed into E. coli BL21-DE3 bacteria. The results of SDS-PAGE showed no evidence of protein expression in any of the conditions of temperature and different levels of IPTG at different cell fractions. So expression of Chit36 protein with the removal of signal peptide (to produce cytoplasmic form) with histidine sequence at the carboxyl end was planned. Bacteria containing recombinant construct were evaluated at different induction conditions. Despite detection of any band in any induction conditions using SDS-PAGE, low expression of proteins in two colonies were confirmed by Western blot assay. In order to optimize the expression condition, recombinant protein expression levels relative to the total bacterial protein in different induction conditions was evaluated using the quantitative measurements of protein bands on SDS-PAGE gels. The results showed that the best condition to induce expression is at OD600: 0.3 and 1 mM IPTG and incubation time of 6 hours. In these conditions expression level of recombinant protein relative to total protein was 45.57%.