خالص‌سازي و تعيين ويژگي هاي بيوشيميايي فنل اكسيداز همولمف شب پره برگ خوار توت Glyphodes pyloalis (Lep.: Pyralidae)

Purification and biochemical characterization of phenoloxidase from hemolymph of Glyphodes pyloalis (Lep: Pyralidae)

آنزيم فنل اكسيداز (EC 1.14.18.1)، يكي از آنزيم هاي كليدي در رشد و ايمني حشرات مي باشد و مهار اين آنزيم مي تواند به عنوان روشي جديد براي كنترل آفات مورد استفاده قرار گيرد. شب پره برگ خوار توت (Glyphodes pyloalis Walker)، يكي از آفات مهم درختان توت در شمال ايران است كه با تغذيه از برگ توت در پرورش كرم ابريشم اختلال ايجاد مي كند. در اين تحقيق، آنزيم فنل اكسيداز از همولمف شب پره برگ خوار توت با استفاده از رسوب با سولفات آمونيوم، كروماتوگرافي ژل و كروماتوگرافي تبادل يوني خالص شد. وزن ملكولي دو ايزوفرم آنزيم با استفاده از SDS-PAGE به ترتيب 66/69 و 53/70 كيلودالتون به دست آمد. اثرات بازدارنده ها نشان داد كه روش مهاركنندگي 4-هگزيل رسورسينول از نوع رقابتي و اما براي كويرسين هيدرات و كوجيك اسيد از نوع مختلط مي باشد. هم‌چنين، بررسي ويژگي هاي آنزيمي نشان داد كه اسيديته مطلوب و دماي بهينه آنزيم فنل اكسيداز به ترتيب برابر با 7 و 35 درجه سلسيوس بود و آنزيم در دماهاي 40، 45 و 50 درجه سلسيوس تا 30 دقيقه پايدار بود. اثر يون هاي فلزي روي آنزيم خالص نشان داد كه يون Zn2+ كاهشي معني‌داري بر فعاليت آنزيم داشت.

Insect phenoloxidase (PO) (EC 1.14.18.1) is the key enzyme in development and immunity of insects. Inhibition of this enzyme could be a new target for pest control. The lesser mulberry snout moth, Glyphodes pyloalis Walker is an important pest of mulberry trees in north of Iran. This pest feeds on mulberry leaves and causes serious problems for the silk industries. In this study, PO from hemolymph of G. pyloalis was purified by ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography and gel filtration. The apparent molecular weights of two isoforms were determined by SDS-PAGE as 69.66 and 70.53 KDa. The inhibitory kinetics of PO showed that the mechanisms were competitive and mixed inhibition for 4-hexylresorcinol, kojic acid and quercetin, respectively. Optimal pH and maximum temperature for PO activity purified from G. pyloalis were 7 and 35 °C, respectively. The purified PO was stable at 40, 45 and 50 ?C for 30 min. The effects of different ions on enzyme activity showed that Zn2+ had a significant inhibitory effect.