كارآيي ترشح و گاماكربوكسيلاسيون فاكتور IX نوتركيب انساني در سلول‌هاي پايدار دروزوفيلا

The efficiency of secretion and γ-carboxylation of recombinant human factor IX in stable drosophila cells

چكيده سابقه و هدف فاكتور IX طي بلوغ خود در كبد، نيازمند كربوكسيلاسيون اسيدآمينه‌هاي گلوتاميك در ناحيه گلا مي‌باشد كه در ترشح و فعاليت آن نقش دارد. با توجه به ناكارآمدي سيستم بياني پستانداران در ترشح و گاماكربوكسيلاسيون كامل فاكتورهاي انعقادي نوتركيب و فعاليت بالاتر آنزيم گاماكربوكسيلاز در سامانه دروزوفيلا (S2)، مطالعه حاضر با هدف بررسي قابليت اين سامانه در گاماكربوكسيلاسيون و لذا ترشح و فعاليت فاكتور IX انجام شد. مواد و روش‌ها در اين پژوهش تجربي، به دنبال تراآلايي سلول‌هاي S2 با وكتور pMT-hFIX، براي ارزيابي كمي بيان و فعاليت فاكتور IX از روش الايزا و aPTT و براي بررسي گاماكربوكسيلاسيون فاكتور IX از روش رسوب‌دهي پروتيين‌هاي محيط كشت به وسيله باريوم سيترات استفاده شد. نمونه‌ها در سه روز متوالي و با سه تكرار و توسط آزمون‌هاي واريانت آنوا و دانكن در سطح 5% بررسي شدند. يافته‌ها نتايج آزمون انعقاد، ترشح فاكتور IX فعال توسط سلول‌هاي S2 پايدار را نشان داد. هم چنين ارزيابي كمي فاكتور IX در محيط كشت و ليز سلولي با الايزا، كارآيي 94 درصدي ترشح را نشان داد. نتايج الايزا نيز در ارزيابي كمي فاكتور IX رسوب داده شده با باريوم سيترات نشان داد كه حدود 45% از فاكتور IX مترشحه از سلول‌هاي S2، كاملاً كربوكسيله‌اند. نتيجه گيري فعاليت فاكتور IX و رسوب آن توسط باريوم سيترات مويد قابليت سلول‌هاي S2 برخلاف ساير سلول‌هاي‌ حشرات در گاماكربوكسيلاسيون فاكتور IX است. نتايج تحقيق، شواهد متقاعد كننده‌اي را فراهم مي‌كند كه گاما‌كربوكسيلاز دروزوفيلا، گاماكربوكسيلاسيون لازم كه براي ترشح و فعاليت انعقادي فاكتور IX لازم است را انجام مي‌دهد.

Abstract Background and Objectives Human factor IX (hFIX) during maturation in the liver requires carboxylation of glutamic amino acids in the Gla domain, which is involved in its secretion and activity. Due to the deficiency of mammalian expression systems in the secretion and fully ?_carboxylation of recombinant coagulation factors and higher activity of ?_carboxylase enzyme in Drosophila S2system, the present study was performed to evaluate ability of this system in ?_carboxylation, secretion and activity of recombinant hFIX. Materials and Methods In this study, following transfection of S2 cells with pMT-hFIX vector, the ELISA and aPTT tests were used to evaluate the expression and activity of recombinant hFIX. In addition, ?_carboxylation of factor IX was approved by barium citrate precipitation. The samples were analyzed on three consecutive days and being repeated three times. Results The coagulation results showed the secretion of active recombinant hFIX by stable S2 cells. Quantitative assessment of recombinant hFIX in medium and cell lysis with ELISA showed 94% secretion efficiency. The results of ELISA on precipitated FIX with barium citrate also indicated that about 45% of secreted recombinant hFIX from S2 cells are fully carboxylated. Conclusions Activity and barium citrate precipitation of recombinant hFIX confirmed the ability of S2 cells, unlike other insect cells, in the ?_carboxylation of factor IX. So, our results provide convincing evidence that Drosophila ?_carboxylase perform necessary ?_carboxylation required for secretion and coagulation activity of recombinant hFIX.