طراحي روش بررسي اتصال سلولي پروتئين‌ها بر پايه الايزا قابل استفاده در ژن‌درماني برون ت

Design Methods of Cell Adhesion Proteins Based on ELISA Usable in-vitro in Gene Therapy

زمینه و هدف: یكی از راهكارهای بهبود ژن درمانی، هدفمند كردن ژن، درمانگر می­باشد. افزودن توالی­های كد كننده پپتیدها و یا پروتئین­های با گرایش بالا به سلول­های هدف ژن­ درمانگر كد كننده پروتئین ترشحی، از جمله این روش­ها محسوب می­شود. با این وجود ارزیابی كارآمدی چنین تغییراتی در هدفمندسازی محصول ژن با روش­های معمول بررسی اتصال سلولی پروتئین­های درمانگر تولید شده در سیستم پروكاریوتی، به طور مستقیم امكان‌پذیر نیست. هدف از این مطالعه طراحی روشی بر مبنای آزمون الیزا برای بررسی اتصال سلولی پروتئین­­­های حاصل از ژن درمانی بود. مواد و روش­ها: به منظور هدفمندسازی ژن درمان‌گر Mda-7، با روش مهندسی ژنتیك، توالی كد كننده پپتید RGD4C، كه گرایش زیادی به اینتگرین­های سطحی سلول­های سرطانی دارد، را درست بعد از توالی پپتید نشانه مصنوعی و در ناحیه كد كننده انتهای آمین پروتئین تعبیه كردیم. سپس این cDNA تغییر یافته و cDNA بدون تغییر در ناقل بیانی یوكاریوتی pCDNA3.1 همسان­سازی شد. ناقل­ها در رده سلولی HEK-293 ترانسفكت شدند. سپس میزان بیان Mda-7 ترشح شده در محیط كشت سلول­ها با آزمون الیزا سنجیده شد. پس از همسان­ كردن غلظت پروتئینMda-7  و RGD.Mda-7 در محیط­های كشت سلول­های ترانسفكت شده، از آنها به عنوان منبع این پروتئین­ها استفاده شد. كاهش غلظت محصول این ژن­ها دو ساعت پس از مجاورت با رده­های سلولی داری اینتگرین­  HepG2، M21 و فاقد اینتگرین Saos-2 با روش الیزا بررسی و مقایسه شد. این آزمایش سه مرتبه به طور مستقل انجام گرفت. داده‌ها با استفاده از آزمون آماری تی تست تجزیه و تحلیل شد. یافته‌ها: بررسی آماری نتایج، حاكی از این بود كه محصول ژن RGD.Mda-7 نسبت به محصول ژن Mda-7 جهت اتصال به سلول‌های دارای اینتگرین  HepG2 و M21 به طور معنی­داری گرایش بیشتری دارد، در حالی كه جهت اتصال به رده سلولی فاقد اینتگرین Saos-2 تفاوت معنی‌داری نداشتند. بحث: به نظر می­رسد روش طراحی شده در این تحقیق، راه­كار مناسبی جهت ارزیابی اتصال سلولی پروتئین­ها در كاربردهای ژن درمانی باشد.

Background & aim: One of the strategies to improve the therapeutic gene is targeting gene therapy. A method which can be considered, is adding code sequences peptide or protein with high tendency to target cells and secreting the therapeutic gene encodes a protein. However, evaluating the effectiveness of such changes in the targeted cell binding protein gene product with the usual therapeutic methods produced in prokaryotic system is directly impossible. The purpose of this study was to evaluate the design methods of cell adhesion proteins based on ELISA usable in-vitro in gene therapy. Methods: In order to target the therapeutic gene Mda-7 by using genetic engineering, peptide coding sequence RGD4C with the tendency to cancerous cell surface integrin were inserted shortly after the artificial signal peptide sequence and the N-terminal coding region of the protein. Then, the modified and unmodified cDNA eukaryotic expression vector pCDNA3.1 were matched. Vectors were transfected in HEK-293 cell line. Then Mda-7 secreted expression levels were measured in cell culture by ELISA. After adjusting the protein concentration of Mda-7 and RGD.Mda-7, in cells transfected media, they were used as a source of protein. Reduce the concentration of these genes was assessed two hours after exposure to the integrin cell lines with HepG2, M21 and lacking integrin Saos-2  were also determined by ELISA. The present study was conducted three times independently.  Data were analyzed using t-test. Results: Statistical analysis of the results suggested that the gene product of the gene product RGD.Mda-7 and Mda-7 to connect to HepG2 cells and M21 were more likely to have integrin. While binding to the cell lines of Saos-2, no significant difference were observed. Conclusions: It seems the present ELISA based method was a suitable strategy for cell attachment assay in gene therapy research.