معتبرسازي روش كروماتوگرافي مايع با كارايي بالا (HPLC ) جهت شناسايي و تعيين مقدار ليزينوآلانين در شير خشك نوزادان

Validation of a HPLC Method for Detection and Determination of Lysinoalanine in Infant Formula

سابقه و هدف: لیزینوآلانین طی تهیه و فرآوری شیر خشك  در اثر حرارت، pH قلیایی با واكنش حذفی بتا، تشكیل دهیدروآلانین و واكنش با تركیبات آمین دار ایجاد می‌گردد. در این مطالعه طراحی و معتبر سازی روشی مناسب جهت شناسایی و تعیین مقدار لیزینوآلانین در شیر خشك نوزادان  با استفاده از كروماتوگرافی مایع با كارایی بالا (HPLC) مد نظر قرار گرفت. مواد و روش‌ها: در این پژوهش ابتدا شرایط بهینه HPLC  (ستون C18، آشكارساز فلورسانس، مشتق سازی توسط دنسیل كلراید، سرعت جریان فاز متحرك ml/min  9/0، شویش گرادیانت و فاز متحرك شامل بافر فسفات  7=pH  و استونیتریل) تعیین شد. بر اساس شرایط فوق روش معتبر سازی گردید و كارآمدی روش معتبر شده با آنالیز 10 نمونه شیر خشك بررسی شد. یافته‌ها‌: نمودار كالیبراسیون در محدوده غلظتی 80- 5  میلی‌گرم بر لیتر، خطی بود. ضریب همبستگی 9949/0= R2 به دست آمد. حد تشخیص (Limit of Detection) mg/L2 و حد تعیین مقدار (Limit of Quantification)mg/L 5 و درصد بازیافت (Recovery) 8/87 _ 7/83 درصد به دست آمد. در ارزیابی دقت روش، انحراف استاندارد نسبی (RSD%) سطح منحنی و غلظت به دست آمده محاسبه شد. برای Intra day به ترتیب كمتر از 87/3 و  7/2 درصد و برای Inter day  به ترتیب كمتر از 2/5 و 4/7 درصد به دست آمد. در 7 مورد از شیرهای آنالیز شده، لیزینوآلانین شناسایی نشد و در 3 نمونه مقدار آن بینLOD, LOQ  به دست آمد. نتیجه گیری: این روش در جهت تشخیص و شناسایی لیزینوآلانین در شیرخشك نوزادان از دقت، صحت و كارایی لازم برخوردار بوده و در دسترس و مقرون به صرفه می‌باشد. واژگان كلیدی: لیزینوآلانین، شیر خشك نوزادان، كروماتوگرافی مایع باكارایی بالا، آشكارساز فلورسانس، معتبرسازی

Background and Objectives: Lysinoalanine (LAL) is created in the course of preparation of infant formula during the heat processing, alkaline pH, b elimination, dehydroalanine production and reaction with amines group. Produced LAL not only results in losses of necessary amino acids’ content, but also could cause nephrotoxic effects. So the formulated infant formula must be free from LAL. In this study, HPLC for detection and determination of LAL was developed and validated. Materials and Methods: HPLC conditions were optimized (C18 Column, Fluorescence detector, Column temperature 30℃, flow rate 0.9 ml/min. Mobile phase consisted of mixed phosphate buffer, pH: 7, acetonitrile and pure acetonitrile in gradient elution), and LAL was dansylated by adding dansyl chloride. The method was validated according to the above conditions. 10 infant formula brands were analyzed according to the validated method. The calibration curve for concentration versus LAL peak area (R2= 0.9949) was linear in the range of 5_80 mg/L. LOD and LOQ were 2 and 5 mg/L respectively, and the accuracy result (recovery range) was within 83.6-87.7%. Assessment of precision showed that the relative standard deviation (RSD%) of concentration  and area peak of spike samples in the intra-day study  were less than 2.7%  and 3.8% respectively, and in inter-day study were less than 7.4% and 5.2%, respectively. In the analyzed infant formula in seven samples, LAL was not detectable, and it was detected between LOD and LOQ only in three samples. Conclusion: This method is a valuable validated way, available, reliable and cost benefit in LAL detection and determination in infant formula. Keywords: Lysinoalanine, Infant formula, HPLC, Fluorescence detector