موتاسيون هدف‌مند، كلونينگ و بيان پروتيين استرپتوكيناز به منظور توليد مولكول جديد مناسب براي پگيلاسيون

Site-Directed Mutation, Cloning and Expression of Streptokinase for Producing a New Suitable Molecule for PEGylation

زمينه و هدف: استرپتوكيناز رايج‌ترين و در حال حاضر مقرون به صرفه‌ترين داروي فيبرينوليتيك براي درمان سكته‌هاي قلبي و گرفتگي رگ‌ها مي‌باشد. علي‌رغم مزايا و برتري‌هايي كه استرپتوكيناز نسبت به داروهاي ترومبوليتيك ديگر دارد، تجويز آن مي‌تواند با مشكلاتي از جمله تحريك سيستم ايمني بدن و هموراژي همراه بوده و هم‌چنين نيمه عمر نسبتا پايين آن منجر به درمان ناقص شود. پگيلاسيون يكي از روش‌هاي رايج براي اصلاح برخي از اين معايب مي‌باشد. مواد و روش‌ها: در تحقيق حاضر براي طراحي و توليد پروتييني مناسب براي پگيلاسيون اختصاصي با سيستيين، نرم افزار SPDBviewer استفاده شد. پس از انجام موتاسيون هدف‌مند به روش SOEing PCR، ژن موتانت (sk45cys) و غيرموتانت (ski) به درون وكتور pET26-b وارد شده و ساختارهاي حاصل به درون اشرشياكلي ترنسفرم شدند. كلون‌هاي حاصل پس از رشد توسط IPTG بيان شده و بيان پروتيين‌ها توسط SD-PAGE و وسترن بلاتينگ بررسي گرديد. پروتيين‌ها با تكنيك افينيتي كروماتوگرافي با ستونNi-NTA تخليص شدند و فعاليت آن‌ها با استفاده از روش كروموژنيك و از طريق سوبستراي S2251 بررسي شد. يافته‌ها: نتايج حاصل از فعاليت سنجي نشان داد كه فعاليت آميدوليتيك sk45cys در مقايسه با ski، پس از 30 دقيقه از تشكيل كمپلكس با پلاسمينوژن، 10 درصد افزايش فعاليت داشته است. نتيجه‌گيري: نتايج نشان دادند كه با توجه به سطحي بودن مكان سيستيين جايگزين شده و هم‌چنين افزايش نسبي فعاليت SK45cys اين پروتيين مي‌تواند مولكول مناسبي براي انجام فرآيند پگيلاسيون اختصاصي باشد.

Background: Streptokinase is one of the most common and cost effective fibrinolytic drugs for treatment of heart attacks and vein thrombosis. Unlike many advantages over other thrombolytic drugs, administration of streptokinase can produce some complications such as immunologic reactions, hemorrhage and incomplete treatment due to relative short half life. Pegylation is one of the most common methods for improving of these shortcomings. Materials and Methods: In this study, designing a proper candidate for specific pegylation with cysteine was done by means of SPDBviewer software. After a meaning ful mutation by SOEing PCR method, mutated (sk45cys) and intact SK (ski) genes were cloned in pET26-b vector and the structures were transformed in E.coli. Clones, Afrer growing, were expressed by IpTG and exptression of proteins was confirmed by SDS-PAGE and western blotting. The proteins were purified by affinity chromatography with NiNTA columns and amidolytic activity of purified proteins was assayed using chromogenic method and different concentrations of S2251 substrate. Results: Results of activity assays showed that amidolytic activity of SK45cys had about 10% increase in comparison to Ski, after 30 minutes of complex formation with plasminogen. Conclusion: Generally, it was concluded that, considering cys45 as a superficial aminoacid and also relative increase of activity, SK45cys can be considered a suitable protein for specific pegylation.