كلونينگ، بيان و تخليص پروتئين پيلين سودوموناس آئروژينوزا در ميزبان پروكاريوتي

Cloning, expression and purification of Pseudomonas aeruginosa pilin protein in the prokaryotic host

زمينه و اهداف: سويه هاي پاتوژن سودوموناس آئروژينوزا پيلي قطبي توليد مي كند كه براي تحرك، چسبندگي و تهاجم مورد نياز است. هدف از اين مطالعه توليد و تخليص پروتئين نوتركيب پيلين مي باشد. مواد و روش ها: ژن كد كننده پيلين (pilA) از سويه PAO1 سودوموناس آئروژينوزا با بوسيله PCR جدا گرديد و در وكتور بياني pET22b كلون شد. تاييد ساختار وكتور نوتركيب به وسيله ي هضم آنزيمي دوگانه و تعيين توالي صورت گرفت. وكتور نوتركيب به داخلي باكتري (E.coli BL21(DE3 ترانسفورم شد و تخليص پروتئين نوتركيب بوسيله كروماتوگرافي تمايلي انجام شد. آزمون وسترن بلات با استفاده از توسط آنتي بادي ضد پلي هيستيدني انجام شد. يافته ها: نتايج تعيين توالي و هضم آنزيمي صحت كلونينگ را تاييد نمود. الكتروفورز پروتئين نشان داد كه وزن مولكولي پروتئين نوتركيب پيلين حدود 19 كيلودالتون مي باشد. همچنين نتايج آزمون وسترن بلات توليد پروتين نوتركيب را تاييد كرد. مقدار پروتئين توليد شده كه به روش اسپكتروفتومتري مستقيم اندازه گيري شد كه مقدار ان.2/58 ميلي گرم به هر ميلي ليتر تعيين شد. نتيجه گيري: نتايج وسترن بلات و اليزا به موازات نتايج تعيين توالي نشان دهنده صحت توليد پروتئين نوتركيب پيلين و حفظ ساختار نسبي آن مي باشد.

Background: Pathogenic Pseudomonas aeruginosa strains produce polar pili has required for motility, adhesion, and invasion. The main aims of the present study are to identify, clone, express and purify the recombinant pilin protein of P. aeruginosa in the prokaryotic host. Material and methods: The recombinant pilin gene (pilA) was isolated from P. aeruginosa PAO1 strain by PCR and cloned into pET22b vector. The recombinant plasmid was subsequently verified by restriction analysis, and DNA sequencing. The recombinant vector was transformed into E. coli BL21 (DE3) strain, then the recombinant pilin overexpressed and affinity purified by NiNTA agaroseaffinity chromatography.Western blot analysis was performed using anti6His tag antibody. Results: The PCR and enzymatic digestion results showed the accuracy of the pilA gene cloning. The protein electrophoresis showed that the molecular weight of recombinant pilin is about 19 kDa. Western blot analysis also confirmed the production of recombinant protein. The amount of produced protein was measured by the direct spectrophotometery method, which was 2/58 mg/mL. Conclusion: Western blot and ELISA results along with that of sequencing ensure accurate production of recombinant pilin, retaining its partial epitopes.