مطالعه اهميت و نقش اسيدهاي آمينه آسپارژين 28 و ليزين 30 فوتوپروتئين اكورين در جذب كلسيم

The role of Asn 28 and Lys 30 of aequorin photoprotein in calcium sensitivity

فوتوپروتئين اكورين جدا شده از عروس دريايي اكوريا ويكتوريا ، فوتوپروتئين حساس به كلسيم است كه از اپواكورين و گروه پروستاتيك كوالنترازين تشكيل شده و دراثر اتصال به كلسيم سبب نشر نور آبي مي شود. اين پروتئين مونومري شامل چهار موتيف EF hand است كه سه موتيف آن مي تواند به كلسيم متصل شود. از سوي ديگر افزايش كلسيم در مغز مي تواند منجر به بيماري هاي عصبي نظير آلزايمر، پاركينسون و سكته مغري گردد. اكورين با توجه به اينكه در گروه پروتئين هاي متصل شونده به كلسيم (CBPs) قرار دارد، همانند يك اسفنج مي تواند كلسيم مازاد را در نرون هاي عصبي جذب نمايد. هدف تحقيق حاضر ايجاد جهش هاي هدفمند در اكورين به منظور افزايش حساسيت آن به كلسيم است.مواد وروش‌ها: در اين تحقيق ، با استفاده از روش جهش زايي هدفمند، دو جهش نقطه اي در اسيدهاي آمينه آسپاراژين 28 و ليزين 30 K30T)و (N28D در ناحيه EF hand  طراحي گرديد و درون سيستم بياني pET21 كلون و بيان شد. با توجه به طراحي دنباله هيستيدين، تخليص پروتئين هاي جهش يافته به كمك ستون هاي نيكله انجام شد و در نهايت حساسيت جهش هاي مذكور به كلسيم با نمونه اوليه، مقايسه گرديد. نتيجه گيري: نتايج حساسيت پروتئين هاي توليدي به كلسيم، نشان داد كه جهش K30T در مقايسه با نمونه اوليه ، حساسيت و ميل تركيبي بالاتري به كلسيم از خود نشان مي دهد.

Introduction: The photoprotein aequorin, isolated from the jellyfish Aequoera victoria, is a calciumsensitive bioluminescent protein formed with the apoprotein apoaequorin and the prosthetic group coelenterazine that emits light upon calcium binding. The protein is believed to be a monomer containing four helixloophelix motifs (EF hand) of which three domains can bind calcium. On the other hand, excess calcium in brain is associated with many neurodegenerative diseases and conditions including Alzheimer’s, Parkinson’s, and stroke. Aequorin as a natural calcium binding protein taking up excess calcium in brain cells much like a sponge. The aim of this study is production of mutant aequorin for calcium sensitivity increase. Material and method: The mutated aequorin (N28D, K30T), in EF hand I, were prepared using site directed mutagenesis and subcloned in the pET21 expression vector. According to design of Histaq, purified mutants aequorin prepared using nickel affinity chromatography. Finally calcium sensitivity compared between wildtype and mutant aequorin.Results: Calcium sensitivity of mutated aequorin indicated aeqK30T is more sensitive than wild type and aeqN28D.