بررسي اثر انجماد شيشه اي بر ميزان بيان نشانگرهاي اختصاصي پرتواني، Oct4 و Nanog، در بلاستوسيستهاي موش سوري

The effect of vitrification on pluripotency specific genes, Oct4 and Nanog in mouse blastocysts

مقدمه: از زمان اولين انجماد شيشه‌اي رويان موش در سال 1985، تلاش‌ها‌ي قابل توجهي براي توسعه و بهبود اين تكنيك صورت گرفته است اما همچنان انجماد با اعمال آسيب‌هاي جدي بيوشيميايي و كروموزومي بر روي رويان مي‌تواند باعث تغييراتي در الگوي بيان ژن‌هاي دخيل در تكوين و عملكرد، كاهش لانه‌گزيني و نهايتا مرگ رويان گردد. هدف از اين مطالعه بررسي تاثيرات انجماد شيشه‌اي بر زنده‌ماني و رشد و بررسي بيان ژن‌هاي تخصصي پرتواني موثر در تكوين رويان از جمله ژن‌هاي Oct4 و Nanog در بلاستوسيست‌هاي منجمد ذوب شده‌ي موش بود. روش كار: پس از تحريك تخمك‌گذاري موش‌هاي ماده و استحصال بلاستوسيست، فرآيند انجماد با حضور دي‌متيل سولفوكسيد 15%، اتيلن‌گليكول 15% و ساكارز 5/0 مولار به عنوان مواد سرما‌محافظ در محيط‌هاي انجمادي انجام شد و بلاستوسيست‌ها با قرار‌گيري روي Cryotop، به درون ازت مايع منتقل گشتند. فرآيند ذوب نيز با شست‌و‌شوي رويان‌ها در محيط ذوب حاوي ساكارز 1 مولار صورت پذيرفت. نهايتا ميزان زنده‌ماني، خروج بلاستوسيست‌ها از زونا و نيز بيان ژن‌هاي Oct4 و Nanog به روش real time PCR در بلاستوسيست‌هاي منجمد ذوب شده و شاهد ارزيابي شد. نتايج: نرخ زنده‌ماني و خروج بلاستوسيست‌ها از زونا در تيمار انجماد نسبت به بلاستوسيست‌هاي منجمد نشده بطور معني‌داري كاهش يافتند (5.81±94.43% در مقابل 100% براي زنده‌ماني و 11.76±57.78% در مقابل5.80± 86.88% براي خروج بلاستوسيست از زونا). همچنين بيان ژن‌هاي Nanog و Oct4 افزايش يافت. نتيجه‌گيري: با توجه به يافته‌هاي اين آزمايش مي‌توان گفت كه انجماد شيشه‌اي بلاستوسيست موش سوري در مرحله‌ي بلاستوسيست مي‌تواند باعث تغيير بيان ژن و كيفيت رويان گردد.

Introduction: From the first vitrification of mouse embryos in 1985, considerable efforts have been made to develop and improve cryopreservation techniques, but still biochemical and fetal chromosomal abnormalities caused by vitrification can cause changes in the pattern of genes expression involved in embryonic development and function, reduced implantation and fetal death. The purpose of this study was to investigate the effects of vitrification on survival and the expression of pluripotency specific genes like Oct4 and Nanog in the vitrifiedwarmed mouse blastocysts. Methods & Materials: Harvested blastocysts from superovulated female mice were vitrified in the presence of dimethyl sulfoxide 15%, ethylene glycol 15% and sucrose 0.5 M as cryoprotectants and vitrified in liquid nitrogen after loading on Cryotop. Thawing process was performed by immersing the blastocysts in thawing solution prepared using sucrose 1 M. Survival and hatching rates were evaluated and also the Oct4 and Nanog genes expression in vitrified thawed and fresh blastocysts (control group) were assessed by real timePCR method. Results: Survival and hatching rates decreased significantly in vitrified blastocysts compared with control group (94.43± 5.81% vs. 100% for survival and 57.78± 11.76% vs. 86.88± 5.80% for hatching). Also increased expression of Nanog and Oct4 genes were observed in vitrified warmed blastocysts. Conclusion: Considering the results of this study, it can be said that vitrification of mouse embryo at the blastocyst stage can change gene expression and quality of the embryo.