بهينه سازي بيان اگزوتوكسين A (دومين I,II)نوتركيب سودوموناس آئروژينوزا، تخليص و ارزيابي آن در آزمايشگاه

Optimization of expression and in vitro characteristics evaluation of Pseudomonas aeruginosa recombinant exotoxin A (domains I and II)

زمينه و هدف: اگزوتوكسين A فاكتور مهم در بيماريزايي سودوموناس آئروژينوزا بوده و خنثي سازي آن در مبارزه با عفونتهاي ناشي از آن كمك كننده خواهد بود. بنابراين در اين مطالعه بهينه سازي توليد و تخليص اگزوتوكسين A (دومين I,II) و ارزيابي اوليه آن بعنوان كانديد واكسن مورد بررسي قرار گرفنه است. مواد و روش كار: بعد از استخراج DNA  از سودوموناس آئروژينوزاي سويه PAO1 و تكثير با PCR، قطعه ژني مورد نظر با اتصال به ناقل Pet22b به Escherichia coli BL21 (E.coli) منتقل و بيان آن با روش SDSPage بررسي گرديد و پروتئين نوتركيب با روش افينيتي كروماتوگرافي تخليص شد. واكنش آنتي ژنيك آن با آنتي بادي ضد اگزوتوكسين A و سرم بيماران مبتلا به عفونت سودوموناس آئروژينوزا با روش وسترن بلاتينگ بررسي گرديد. يافته ها: بر اساس نتايج اين مطالعه قطعه ژني اگزوتوكسين A (دومين I,II) سودوموناس آئروژينوزا با اندازه bp 1212 در ژل الكتروفورزمحصول PCR مشاهده گرديد كه مقايسه توالي ژن كلون شده با توالي ژن اگزوتوكسين سودوموناس آئروژينوزاي سويه PAO1، صحت توالي را تاييد كرد. بيان در E. coli BL21 باعث توليد پروتئين مورد نظر با اندازه تقريبي  KD45 گرديد. بيان در شرايط مختلف نشان داد القاي 4 ساعت با نيم ميلي مولارIPTG در دمايC˚ 28 بهترين شرايط توليد پروتئين با غلظت بالا بود. نتايج نشان داد اين پروتئين در وسترن بلاتينگ با آنتي بادي ضد اگزوتوكسين A سودوموناس آئروژينوزاي و سرم بيماران مبتلا به عفونت سودوموناس بخوبي واكنش نشان داد. نتيجه گيري: سيستم استفاده شده سيستم مناسبي براي توليد اگزوتوكسين A (دومين I,II) نوتركيب است و مي تواند براي توليد اين پروتئين در مقياس بالا مورد استفاده قرار گيرد.

Background Objectives:  P. aeruginosa exotoxin A plays an important role in virulence of the bacterium and its neutralization can abolish the P. aeruginosa pathogenicity. Therefore, we showed optimization of recombinant production and in vitro antigenic characteristics evaluation of exotoxin A (domains I and II) as a vaccine candidate. Material Methods: In this study, after DNA extraction and lification with PCR, gene fragment was ligated to Pet22b vector and transferred to E.coli BL21. The protein expression was evaluated by SDSPAGE method. The NiNTA affinity chromatography was used for recombinant protein purification. Then, the reactivity of recombinant exotoxin A with antiexotoxin A antibody (Sigma) and sera from P. aeruginosa infected patients was evaluated by western blotting method. Results: Sequencing of cloned gene showed that the sequence of exoA III gene was in accordance with exoA III from P. aeruginosa PAO1. SDSPAGE analysis indicated that expression of recombinant protein with a molecular weight of 45kD. The results showed, 4 hours induction with IPTG = 0.5mM/m in 28˚C is optimum condition for expression protein. Western blot analysis of the purified protein demonstrated that ExoA III could be recognized by antibody against native exotoxin A and the serum of patients with P. aeruginosa infection. Conclusion: These results suggest that recombinant exoA III protein can be produced in the laboratory and this system can be used for large scale production of this protein for subsequent immunological studies. Key words: Pseudomonas aeruginosa vaccine candidate exotoxin Arecombinant vaccine