كلونينگ و ارزيابي بيوانفورماتيكي ژن مونودهيدروآسكوربات ردوكتاز (MDHAR) در گياه آلوروپوس ليتوراليس و بررسي بيش بيان آن در گياه توتون (Nicotina tobacum)

شوري خاك يكي از مهم­ترين عوامل غيرزنده­، با برهم زدن شرايط مطلوب است كه سبب بروز اختلالات متابوليسمي در سلول هاي گياهي، از جمله افزايش توليد انواع گونه­هاي اكسيژن فعال (ROS) مي­گردد .مونودهيدروآسكوربات ردوكتاز (MDHAR) يكي از آنزيم هاي كليدي در مسير گلوتاتيون-آسكوربات است كه نقش احياكنندگي راديكال هاي مونودهيدروآسكوربات را بر عهده دارد. در تحقيق حاضر آنزيم مونودهيدرو آسكوربات ردوكتاز، از گياه هالوفيت آلوروپوس ليتوراليس (Aeluropus littoralis) شناسايي، جداسازي و هم سانه­سازي گرديد و به گياه توتون انتقال داده شد. براي اين منظور با توجه به اطلاعات در دسترس در پايگاه NCBI، پرايمرهاي مناسب طراحي و با روش RT-PCR توالي ژني مذكور تكثير و به منظور توالي يابي در وكتور pTZ57R/T درون باكتري اي.كلاي (DH5α) هم سانه­سازي شد. سپس به منظور انتقال به گياه توتون، با آنزيم pfu دي. ان. آ. پليمراز تكثير گرديد. پس از الحاق پروموتر و ترميناتور 35S به ناقل بياني pGreen0029، توالي ژني MDHAR نيز به اين ناقل وارد شد و سازه­ي نوتركيب به سلول­هاي اگروباكتريوم نژاد LBA4404 ترانسفورم شد و براي تراريخت­سازي توتون به روش ديسك برگي مورد استفاده قرار گرفت. از گياهان باززايي شده در محيط انتخابي حاوي آنتي­بيوتيك كانامايسين استخراج DNA و سپس RNA صورت گرفت و آزمون­هاي PCR و RT-PCR انجام شد. آزمون PCR با DNA گياهان انتخابي نشان داد توالي ژني MDHAR به سلول­هاي گياهان تراريخت وارد شده و بيان مستمر اين ژن نيز توسط آزمون RT-PCR تاييد شد. بررسي­هاي بيوانفورماتيكي روي ژن نشان داد كه ژن MDHAR شامل 1436 جفت باز و فاقد نواحي اينتروني است. مقايسه­ي توالي به دست آمده با توالي­هاي ساير MDHAR­هاي گياهي ثبت شده در بانك ژن، بيانگر شباهت بالاي اين ژن با ساير MDHR­هاي جدا شده از گياهان خانواده­ي گندميان بوده كه با MDHAR­ سورگم (Sorghum bicolor)، بيشترين شباهت را داشت. آناليز ساختار پروتئيني، بين سلولي بودن و نواحي موتيف pyr-redoxin و SDR را اثبات كرده و نيز بررسي ساختار ثانويه، نشان­دهنده­ي 3/78 درصد ساختار مارپيچ آلفا، 1/41 درصد ساختار چين خورده ي بتا و 6/13 درصد ساختار دور بتا يا دور معكوس بود.