كلونينگ و بيان آنزيم درماني اوريكاز آسپرژيلوس فلاووس در اشريشياكلي

Cloning and Expression of Therapeutic Enzyme, Aspergillus Flavus Uricase in E. coli

زمينه و هدف: اوريكاز (EC 1.7.3.3) آنزيمي است كه باعث كاتاليز اوريك اسيد به H2O2 و الانتوئين مي شود و در درمان نقرس استفاده مي شود. هدف اين تحقيق كلون سازي ژن سنتتيك كدكننده ي آنزيم اوريكاز آسپرژيلوس فلاوس در پلاسميد pET28a(+) و بيان نوتركيب آن در اشريشياكلي مي باشد. روش بررسي: بعد از استخراج توالي ژني از پايگاه داده ها، ژن كدكننده ي اوريكاز بهينه سازي شد و سنتز آن سفارش داده شد. سپس ژن سنتتيك در پلاسميد pET28a(+) در بين آنزيم هاي NcoI و XhoI سابكلون شد و توسط روش هاي هضم آنزيمي، PCR و تعيين توالي كلون سازي صحيح آن تاييد شد. بعد از انتقال آن به باكتري Bl21 به روش شيميايي والقا آن توسط IPTG، بيان آن بهينه سازي شد. براي ارزيابي القا آنزيم نوتركيب، ژل الكتروفورز پروتئين استفاده شد. يافته ها: نتايج حاصل از هضم آنزيمي، PCR و تعيين توالي نشان داد كه آنزيم اوريكاز به طور صحيح در جايگاه مورد نظر كلون سازي شده است. دماي 22 درجه ي سانتي گراد و زمان 6 ساعت با غلظت IPTG 1 ميلي مول براي بهينه سازي بيان آنزيم به دست آمد. نتايج الكتروفورز آنزيم نوتركيب، جرم مولكولي 5/34 كيلودالتون را براي آنزيم بيان شده نشان داد. تعيين فعاليت آنزيمي مشخص كرد كه فعاليت ويژه ي آنزيم اوريكاز 69/7 واحد بر ميلي گرم است و آنزيم به لحاظ عملكردي فعال است. نتيجه گيري: نتايج پژوهش حاضر نشان داد كه ژن اوريكاز را مي توان به آساني در سيستم بياني pET كلون و بيان كرد. نتايج تعيين فعاليت ويژه مشخص كرد كه پروتئين آنزيمي به صورت محلول در سيتوزول اشريشيا كلي توليد شده است و از نظر كاتاليتيكي فعال است.

Background and Objective: Uricase (EC 1.7.3.3) is an enzyme which catalyses uric acid to H2O2 and alantoin and is utilized in the treatment of hyperuricemia or gout. The aim of this study was cloning of Aspergillus flavus uricase synthetic gene into pET28(a) and its recombinant expression in E. coli Materials and Methods: The coding sequence of uricase retrieved from gene bank and once optimized, the gene synthesis was ordered.nbsp; Then, the synthetic gene subcloned between NcoI and XhoI within the vector. The proper subcloning was confirmed by enzymatic digestion check, PCR and finally DNA sequencing.nbsp; The construct, then chemically transformed into E. coli BL21 and induced by IPTG which followed by overexpression optimization.nbsp; For enzyme expression evaluation, protein gel electrophoresis was utilized. Results: Restriction check, PCR and sequencing indicated that the coding sequence of enzyme was cloned in the desired point of vector. The optimized condition obtained for enzyme expression was IPTG 1mM for 6 h at 22 deg;C. Enzyme molecular weight was determined 34.5 kDa by electrophoresis. Evaluation of uricase specific activity showed that the expressed enzyme is 7.69 U/mg and it is catalytically active. Conclusion: The results of the current research showed that the uricase gene could be simply cloned and expressed in pET system. Enzyme specific activity determination exhibited that the enzyme was produced as a soluble protein and catalytically active in E. coli cytosole.nbsp;