طراحي، همسانه‏سازي و بررسي بيان ژن NP در ناقل دوسيستروني واجد ژن اينترلوكين 18 موشي با هدف استفاده در مطالعات واكسن آنفلوانزا

Design, Cloning, and Expression assay of the NP Gene in a Bicistronic Vector Harboring the Mouse IL-18 Gene: Potential Implications for Type A Influenza Vaccine Investigations

هدف: در حال حاضر واكسيناسيون مهم‏ترين استراتژي در كاهش آمار مبتلايان و مرگ و مير ساليانه ناشي از آنفلوانزا فصلي تلقي مي‏شود. بر خلاف آنتي‏ژن‏هاي سطحي مورد استفاده در تركيب واكسن‏هاي موجود، پروتيين‏هاي داخلي ساختاري و غير ساختاري ويروس آنفلوانزا به خوبي حفاظت شده هستند. با توجه به سطح حفاظت شدگي نسبتا بالاي نوكليوپروتيين ويروس آنفلوانزا و قابليت ادجوانتي اينترلوكين 18 در تحريك پاسخ‏هاي ايمني و ميل به Th1، اين مطالعه در صدد ساخت يك پلاسميد دو سيستروني با قابليت بيان ژن‏هاي NP و اينترلوكين 18 موشي بود تا در صورت نيل به اين هدف به‏عنوان يك كانديد واكسن قابليت ايمني‏زايي آن در مطالعات بعدي ارزيابي شود. مواد و روش‏ها: در مرحله اول RNA ژنومي ويروس آنفلوانزا تيپA سويه H1N1/ PR8 استخراج شد و پس از توليد cDNA، توالي ژن كد كننده NP با استفاده از آغازگر اختصاصي ژن و با روش PCR تكثير شد. در مرحله بعد ژن NP در ناقل همسانه‏سازي pJET1.2/blunt همسانه‏سازي شد. پس از تاييد درستي همسانه‏سازي ژن در ناقل pJET1.2/blunt از طريق تعيين توالي، هضم آنزيمي و PCR، قطعه مزبور توسط هضم آنزيمي دو گانه خارج شد. پلاسميد pIRES-Igk/mIL18/Fc با استفاده از آنزيم‏هاي BstXI/NotI هضم دوگانه شد و قطعه مربوط به eGFP خارج شد. سپس فرآيند الحاق ژنNP در ناقل دو سيستروني pIRES-Igk/mIL18/Fc هضم شده با استفاده از آنزيم T4 ليگاز صورت پذيرفت. محصول ليگاسيون به سويه استاندارد DH5? ترانسفورم شد و انتخاب كلوني‏هاي مثبت با استفاده از كلوني PCR صورت پذيرفت. به‏منظور بررسي درستي همسانه‏سازي از آزمون PCR، هضم آنزيمي و تعيين توالي استفاده شد. در نهايت بيان ژن NP و اينترلوكين 18 از سازه ژني mIL-18-pIRES2-NP در رده سلولي BHK-21 و RAW264.7 ترانسفكت شده با پلاسميد به وسيله رنگ آميزي ايمنوفلورسنت غير مستقيم و الايزا ارزيابي شد. نتايج: نتايج PCR، هضم آنزيمي و تعيين توالي با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي به صورت دو جهته نشان داد كه ژن NP ويروس آنفلوانزا در ناقل pIRES-Igk/mIL18/Fc به‏صورت موفق و در راستاي درست كلون شده است. ترانسفكشن و بررسي قابليت بيان سازه ژني mIL-18-pIRES2-NP با استفاده از رنگ آميزي ايمنوفلويورسانس و الايزا بيان موفق‏آميز ژن‏هاي NP و اينترلوكين 18 از mIL-18-pIRES2-NP در سلول يوكاريوتي را اثبات كرد. نتيجه‏گيري: نتايج به‏دست آمده در اين تحقيق بيان موفقيت‏آميز ژن NP و اينترلوكين 18 از سازه mIL-18-pIRES2-NP را نشان داد. با توجه به آثار ادجوانتي سايتوكاين اينترلوكين 18، پلاسميد ساخته شده مي‏تواند به عنوان يك كانديد مناسب واكسن ژني براي پيشگيري از عفونت ناشي از ويروس آنفلوانزا در مطالعات ارزيابي ايمنولوژيك آتي مطرح شود.

Objective: Vaccination is the most effective tool to prevent influenza virus morbidity and mortality. Despite surface antigen mutability, the influenza virus inner proteins are remarkably conserved among various strains. The high similarity of NP protein sequences among various strains of influenza type A from one side, and the potency of IL-18 molecular adjuvant in shifting immune response toward Th1 from the other side, has persuaded us to evaluate the possibility to clone and express the influenza type A NP gene in a bicistronic vector that harbored the mice IL-18 gene. We sought to assess their immunogenic activities in a susceptible mouse model. Methods: Initially, we extracted genomic RNA from the influenza virus PR8. After cDNA synthesis, the target gene encoding NP was amplified by PCR after which the NP gene was cloned in the pJET1.2/blunt TA vector. The accuracy of cloned gene was confirmed by PCR, enzymatic digestion and sequencing. The pJET1.2 -NP plasmid and pIRES-Igk/mIL18/Fc plasmids were simultaneously digested by BstXI/NotI enzymes. We inserted the digested NP fragment into the pIRES-Igk/mIL18/Fc plasmid using T4 ligase. Transformation into DH5? and colony selection was done. Gene cloning was confirmed by PCR, enzymatic double-digestion and sequencing. Eventually, by transfection of the constructed mIL-18-pIRES2-NP plasmid into BHK-21 and RAW264.7 cell lines, we assessed the expressions of NP and IL-18 by indirect immunofluorescence and ELISA, respectively. Results: Electrophoresis of the PCR product, enzymatic digestion, and sequencing showed that the influenza NP gene successfully cloned into pIRES-Igk/mIL18/Fc to generate the mIL-18-pIRES2-NP plasmid. Indirect immunofluorescence and ELISA indicated the successful expressions of NP and mIL-18 from the produced plasmid in eukaryotic cell lines. Conclusion: The results of the present study confirm expressions of NP and IL-18 genes from mIL-18-pIRES2-NP. This is a proper candidate for influenza A gene vaccine in future investigations.