جداسازي، همسانه‌سازي و بيان فاكتور سلول بنيادي با استفاده از سيستم بياني پروكاريوتي

Isolation, cloning and expression of human stem cell factor using prokaryotic expression system

چكيده سابقه و هدف فاكتور سلول بنيادي(SCF)، يك گليكوپروتيين 28 تا 40 كيلودالتوني است كه نقش مهمي را در تكثير و تمايز سلول هاي بنيادي خونساز(HSCs) بازي مي كند. هدف اين مطالعه جداسازي، كلونينگ و بيان SCF در ميزبان بيانيRosetta بود. Rosetta علاوه بر ويژگي هاي ميزبان بياني پروكاريوتي، انتظار مي‌رفت با فراهم كردن كدون هاي نادر پروتيين هاي يوكاريوتي، سطح بيان پروتيين نوتركيب را افزايش دهد. مواد و روش‌ها مطالعه انجام از نوع تجربي بود. RNA تام از سلول‌هاي Hela استخراج و به دنبال آن cDNA ساخته شد. توالي رمزكننده SCF ، به وسيله آغازگرهاي اختصاصي جداسازي و تكثير شد و با استفاده از وكتور بياني pET-32a در E.coli TOP 10 همسانه‌سازي شد. سازه نوتركيب به وسيله PCR ، هضم آنزيمي و تعيين توالي تاييد ‌شد. وكتور نوتركيب در ميزبان بياني Rosetta تراريخت ‌شد. بيان SCF نوتركيب در حضور IPTG القا شد. بيان فاكتور سلول بنيادي انساني(hSCF) با SDS-PAGE و وسترن بلات ارزيابي و تاييد شد. يافته‌ها توالي رمزكننده SCF با موفقيت از سلول‌هاي Hela جداسازي و در وكتور بياني pET-32a همسانه‌سازي و بيان پروتيين نوتركيب در ميزبان بياني Rosetta انجام شد. نتيجه‌گيري در سيستم بياني Rosetta ، امكان توليد پروتيين‌هاي يوكاريوتي با كدون‌هاي نادر مثل AGG ، AGA ، AUA ، CUA ، CCC و GGA وجود دارد بنابراين به ميزان بالايي پروتيين فاكتور سلول بنيادي توليد مي‌شود.

Abstract Background and Objectives Stem cell factor (SCF) is a 28-40 kDa glycoprotein which plays an important role for the proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells (HSCs). SCF binds to the C-kit receptor, and improves the survival of HSCs in vitro. SCF is one of the essential supplements for cultivation of HSCs in vitro. It plays a vital role to increase the number and size of HSC colonies. Materials and Methods In this experimental study, glycosylation of SCF does not seem to influence its biological activity; therefore, it would be possible to produce it in prokaryotic expression system. The aim of this study was isolation, cloning and expression of SCF in the Rosetta expression host. In addition to the features of prokaryotic expression system, Rosetta was expected to provide rare codons of eukaryotic proteins and increase the recombinant protein expression level. Results The SCF coding sequence was isolated and amplified using the specific primers and cloned in E.coli TOP10 using pET-32a expression vector. The recombinant construct was confirmed by PCR, digestion and sequencing. The recombinant vector was transformed to the expression host, Rosetta. Conclusions The SCF coding sequence was successfully isolated and cloned into the expression vector pET-32a, followed by recombinant protein expression in Rosetta host strain.