خاموش‌سازي سيستماتيك ژن كدوئين اُ‌دمتيلاز (CODM) با استفاده از فن القاي خاموشي‌ از طريق ويروس (VIGS) در گياه دارويي شقايق (Papaver somniferum L.)

Systematic silencing of codeine Odemethylase (CODM) gene, using virusinduced gene silencing (VIGS) technique in Papaver somniferum L.

گياه شقايق (Papaver somniferum L.) به عنوان مهمترين منبع اقتصادي توليد تركيبات آلكالوئيدي ناركوتيك مانند كدئين، تبائين، ناركوتين و پاپاورين شناخته شده است و از تركيبات آن در صنعت داروسازي به عنوان بي‌حس كننده، ضد‌ سرفه و ضد ‌اسپاسم استفاده مي‌‌شود. امروزه از فن مهندسي متابوليك، براي دستورزي ژن‌هاي بيوسنتز آلكالوئيدها و فرآورده‌هاي متابوليكي اين گياه از طريق مهندسي ژنتيك استفاده مي‌شود. كدئين اُ‌دمتيلاز (CODM)، آنزيم انتهايي در مسير بيوسنتزي مورفينان در گياه شقايق مي‌باشد كه باعث دمتيلاسيون تبائين در موقعيت 3 و تبديل آن به اوريپاوين و همچنين دمتيلاسيون كدئين مي‌شود. اين پژوهش با هدف خاموشي احتمالي ژن CODM از طريق مكانيسم خاموشي ژن به واسطه ويروس (VIGS) به اجرا در آمد. ابتدا ژن CODM با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي از روي cDNA تكثير شد. بخشي از انتهاي cDNA سنتز شده در ناحيه 3́ UTR، به عنوان قطعه هدف خاموشي در ناقل ويروسي TRV2 همسانه‌سازي شد و سازه ژني با استفاده از اگروباكتريوم به نمونه‌هاي برگي گياه شقايق انتقال داده شد. بوسيله PCRژن پروتئين پوششي ويروس TRV، گياهان تراريخت غربال اوليه شدند و سپس آناليز نيمه كمي بيان ژن CODM روي تعدادي از آنها انجام شد. آناليز نهايي خاموشي ژن ناشي از مكانيسم VIGS با استفاده از PCR زمان واقعي در بهترين گياهان تراريخت انتخاب شده، كاهش 95 درصدي بيان ژن CODM در مقايسه با نمونه‌هاي شاهد را نشان داد.

Papaver somniferum L. is the most important commercial source of production of morphinan alkaloid component, such as codeine, thebaine, narcotine and papaverine that are exploited by the pharmaceutical industry as analgesics, antitussives and antispasmodics. Recently, metabolic engineering technology for genetic manipulation of alkaloid biosynthesis and metabolic products has been used via production of transgenic plants. Codeine Odemethylase (CODM) catalyzes the late step of morphine biosynthesis in opium poppy for conversion of thebaine to oripavine and codeinone and codeine to morphine via demethylation mechanism. This study was conducted in silencing of CODM gene using VIGS technique. cDNA was amplified using specific primers, and then a part of this cDNA at the 3́ UTR terminal was subcloned in TRV2 vector in Agrobacterium as silencing fragment. Plant leaves was inoculated via Agrobacterium containing silencing fragment. Initial screening of transformed plants was conducted via PCR on tobacco rattle viral coat protein gene (TRVCP) and then, some positive TRV plants were analyzed using semiquantitative RT PCR. The final analysis of VIGS was performed using realtime PCR. Based on the results 95 percent reduction in gene expression of CODM in transgenic plants compared to the control plants was achieved.