تأثير يون‌هاي فلزي بر فعاليت و پايداري آنزيم‌هاي پيرازين‌ آميداز نوع وحشي و جهش‌ يافته

Effect of metal ions on the activity and stability of wild type and mutant pyrazinamidases

مقدمه: پيرازينآميداز يك متالوآنزيم مونومري با فعاليت هيدرولازي است و مسئول تبديل داروي ضدسل پيرازينآميد به شكل فعالش يعني پيرازينوئيك اسيد است. جايگاه اتصال به فلز در آنزيم پيرازين آميداز مايكوباكتريوم توبركلوزيس حاوي يك آسپارتيك اسيد (آسپارتيك اسيد49) و سه هيستيدين (هيستيدين 51، هيستيدين57 و هيستيدين71) است. بروز جهش در ژن پيرازينآميداز (pncA) مسؤول اصلي مقاومت پيرازينآميدي است و ميتواند جايگاه اتصال به فلز را تغيير دهد. ازاينجهت، بررسي تأثير يونهاي فلزي مختلف بر فعاليت و پايداري آنزيم پيرازين آميداز نوع وحشي و جهش يافته ميتواند مهم باشد. مواد و روشها: در اين مطالعه ناقل بياني حاوي ژن پيرازين آميدازهاي نوع وحشي و جهش يافته به اشرشيا كلي سويۀ BL21 منتقل شد سپس پروتئين هاي نوتركيب بيان و تخليص شدند. ميزان تخليص با روش الكتروفورزSDSPAGE ارزيابي شد؛ سپس فعاليت و پايداري آنزيم هاي خالص شده در حضور غلظت يك ميلي مولار از يون هاي دوظرفيتي نيكل (Ni2+)، آهن (Fe2+) و منگنز (Mn2+) بررسي شد. نتايج: بررسي ژل حاصل از الكتروفورز SDSPAGE نشان داد كه آنزيم هاي بيان شده، خالص شدهاند. بررسي فعاليت و پايداري در حضور فلزات نشان داد كه نيكل باعث افزايش فعاليت و پايداري آنزيم هاي نوع وحشي و جهش يافته ها (جهشيافته ۱: L151S و جهش يافته 2 (سه گانه): A143T/T168A/E173K) شد. آهن باعث كاهش فعاليت و پايداري جهش يافتۀ 1 شد؛ اما بر ساير آنزيم ها تأثير چشمگيري نداشت. منگنز باعث كاهش فعاليت و پايداري آنزيم ها شد. بحث و نتيجه گيري: يون نيكل نسبت به يونهاي آهن و منگنز ميان كنش هاي مساعدتري با جايگاه اتصال به فلز در پيرازين آميداز نوع وحشي و جهش يافته ها برقرار كرد و بنابراين باعث افزايش فعاليت و پايداري آنزيم ها شد.

Introduction: Pyrazinamidase is a metalloenzyme with hydrolyzing activity which is responsible for conversion of pyrazinamide (anti tuberculosis drug) to active molecule, pyrazinoic acid. The metalbinding site in the enzyme is composed of Asp49, His51, His56 and His71. Mutations in the pyrazinamidase gene are responsible for resistance to pyrazinamide in Mycobacterium tuberculosis and can alter the binding of metal ions to the metal binding site in the enzyme. Therefore, it is important to study the effect of metal ions on the enzymatic activity and stability of the wild type and mutant pyrazinamidases. Materials and methods: In this study, E. coli BL21 was transformed by expression vectors carrying wild type and mutant pyrazinamidase genes. The recombinant proteins were expressed and then purified by Ni agarose column. The purity of the purified proteins was analyzed by SDSPAGE electrophoresis. Finally, the activity and stability of the purified enzymes were studied in the presence of 1mM of Ni2+, Fe2+ and Mn2+. Results: SDSPAGE analysis showed that the expressed enzymes were purified. The activity and stability results depicted that Ni2+ increases the activity and stability of the wild type and mutant (mutant1: L151S, and mutant2 (triple): A143T/T168A/E173K) enzymes. Fe2+ decreased the activity and stability of mutant1, but has no significant effect on other enzymes. The activity and stability of the enzymes decreased in the presence of Mn2+. Discussion and conclusion: Ni2+ interact favorably with metal binding site of the wild type enzyme and mutants compared with Fe2+ and Mn2+ and then increases the activity and stability of the enzymes.