رنگ آميزي معكوس: روشي موثر براي تخليص پروتئين HIV-1 Nef در سيستم بيان پروكاريوتي

سابقه و هدف: پروتئين Nef، يكي از پروتئين­ هاي تنظيمي ويروس HIV، داراي اپي­توپ­ هاي حفاظت شده متعددي است كه در افراد آلوده به ايدز پاسخ­ هاي ايمني قدرتمندي عليه آن ها مشاهده شده است. بنابراين، پروتئين Nef كانديد مناسبي براي توليد واكسن مي­ باشد. هدف اين پژوهش كلونينگ و بيان پروتئين Nef در سيستم بيان پروكاريوتي و تخليص آن به روش رنگ­آميزي معكوس مي­ باشد. مواد و روش­ ها: توالي كدكننده پروتئين Nef از وكتور pUC19 توسط PCR تكثير شد و الحاق آن به داخل وكتور بياني pGEX6p2 انجام شد. اين سازه طي فرايند ترانسفورماسيون به سويه باكتري E.coli BL21 منتقل شده و القاي بيان پروتئين با استفاده از آنتي­رپرسور IPTG صورت گرفت. تاييد بيان پروتئين با استفاده از آناليز SDS-PAGE و وسترن بلات توسط آنتي­ بادي ضد Nef بررسي گرديد. تخليص پروتئين با استفاده از تكنيك رنگ آميزي معكوس از روي ژل انجام شد. نتايج: نتايج آناليز PCR و هضم آنزيمي وجود باند واضح حدود 648 جفت باز را روي ژل آگاروز تاييد كرد كه نشان­گر كلونينگ صحيح ژن Nef در وكتور بيان پروكاريوتي pGEX6p2 مي­ باشد. هم­ چنين، وجود باند حدود 50 كيلودالتون نشان­گر بيان پروتئين Nef توسط آنتي­بادي منوكلونال ضد Nef در آناليز وسترن بلات تاييد شد. در نهايت، باند خالص شده پروتئين توسط تكنيك رنگ­آميزي معكوس به ­دست آورده شد. نتيجه­ گيري: پروتئين نوتركيب Nef بيان شده در ميزبان E. coli با بازده مناسب توسط روش رنگ­ آميزي معكوس تخليص شد. پروتئين Nef در آينده به­ عنوان يك آنتي­ژن براي طراحي واكسن پروتئيني در مقابل عفونت ويروس HIV استفاده خواهد شد.