مطالعه تغييرات ميزان بيان دو ژن از خانواده ژني ZmPIPتحت تنش هاي محيطي غيرزنده در برگ ذرت (Zea mays cv704)

Abiotic stresses effects on expression of two genes of ZmPIP family in leaves of maize (Zea mays cv 704)

مقدمه گياهان پيوسته در معرض مجموعه‌اي از عوامل محيطي تنش‌زا قرار مي‌گيرند كه اين عوامل تنش‌زا بسياري از جنبه‌هاي ژنتيك و زيست مولكولي گياه را تحت تاثير خود قرار مي‌دهند. در اين بين شوري (NaCl ,CaCl2)، خشكي از مهمترين عوامل تنش‌زاي محيطي به حساب مي‌آيند. براي مقابله با اين شرايط، گياه بايد قادر به درك، پاسخ‌دهي و سازگاري نسبت به اين تغييرات محيطي باشد. مسير signal transduction و ژن‌هاي مربوط به آن نقش مهمي در پاسخ به محرك‌هاي محيطي در گياهان ايفا مي‌كنند. تنش خشكي دامنه‌اي از پاسخ‌هاي فيزيولوژيكي و بيوشيميايي را در گياهان القاء مي‌كند. اين پاسخ‌ها شامل بسته شدن روزنه‌ها، مهار رشد سلول، فتوسنتز و فعاليت تنفسي (Bartels and Sunkars, 2005). از طرفي شوري باعث كاهش ميزان كلسيم و پتاسيم و افزايش سطح سديم و كلر مي‌شود. علاوه بر تمام اين‌ها, تنش شوري تجمع گونه اكسيژن فعال (ROS) را باعث مي‌شود كه مي‌تواند براي غشاي ليپيدي، پروتئين‌ها و اسيد‌هاي نوكلوئيك صدمه‌زننده باشد(Bartels and Sunkars, 2005). برگ‌ها ارگان‌هاي كليدي براي تبخير و فتوسنتز هستند و يك نقش حياتي در رشد گياهان ايفا مي‌كنند. AQPها پروتئين‌هاي سرتاسري اصلي هستند كه حركت آب ،CO2 و ديگر مواد محلول كوچك را از طريق غشاي زيستي تسهيل مي‌كنند. بيان آكوآپورين هاي غشاي پلاسمائي (PIP ها،پروتئين اصلي غشاي پلاسمائي) در بخش هاي هوائي گونه‌هاي گياهي مختلفي گزارش شده است(Maurel et al., 2002). طي مطالعات مولكولي در اين پژوهش، بيان 2 ژن ZmPIP شامل ZmPIP1,2 و ZmPIP1,5 در برگ ذرت با استفاده از روش بيان ژن، مورد بررسي قرار گرفتند. مواد و روش ها بذرها در خاكي با نسبت معين از پرليت و ماسه، در فيتتوترون در دماي 22 درجه سانتيگراد و رطوبت 70%، نسبت طول روز به طول شب 8:16 با شرايط كشت يكسان براي همه گياهان، كاشته شد. پس از گذشت 21 روز از كشت، تيمار گياهان آغاز گرديد. تيمار بطور كوتاه مدت (4 روزه) و بلند مدت (8 روزه) براي سه تنش، شوري NaCl(200mM) ، CaCl2(40mM) و خشكيPEG6000(10%) اعمال شد. RNA كل به روش تريزول از نمونه‌ها استخراج و كيفيت RNA از طريق اسپكتروفتومتري و الكتروفورز ژل آگارز تعيين شد. cDNA با استفاده از RNA استخراج شده و كيت cDNA (Fermentas) طبق دستورالعمل شركت سازنده ساخته شد و سپس RTPCR تحت شرايط شخص اعمال گرديد. ژن GAPDH به عنوان ژن رفرنس داخلي استفاده شد. محصولات RTPCR روي ژل آگارز 5/1درصد حاوي اتيديوم برومايد 5/0 ميكروگرم بر ميلي‌ليتر جداسازي و با استفاده از سيستم Gel Logic 212 Pro Carestream, USA عكس‌برداري شد‌ند. شدت (intensity) باندها با استفاده از نرم افزار Image J اندازه‌گيري و نمودارها با استفاده از excel 2007 رسم شد. آناليز آماري با نرم افزار SPSS انجام شد. نتايج طبق نتايج به‌دست آمده از آناليز نيمه كمي RTPCR ميزان بيان ژن‌هاي ZmPIP1,5 ,ZmPIP1,2 در برگ گياهاني كه تحت تنش هاي مختلف قرار گرفتند نسبت به برگ گياهان شاهد الگوي بيان متفاوتي(كاهش يا افزايش) از خود نشان مي‌دهند. نتايج ما نشان داد كه ژن‌هاي خانواده ZmPIP براي دريافت موثر تغييرات محيطي ضرورت دارد. نتيجه گيري در اين پژوهش، مشاهده شد با اعمال تنش روي گياه الگوي بيان ژن در خانواده ZmPIP تغيير كرد، در بين تنش‌هاي اعمال شده با توجه به آناليز RTPCR و بررسي ميزان بيان نسبي ژن‌ها، تنش CaCl2(40mM)، و به‌خصوص خشكي PEG(10%) داراي اثرات مشخصي در تغيير الگوي بيان ژن‌هاي بررسي شده داشتند كه نشان‌دهنده اثرگذاري اين تيمارها بر بيان آن ژن‌ها است. به‌طور كلي افزايش يا كاهش ميزان بيان ژن نشان‌دهنده درك تنش توسط گياه و پاسخ به آن مي‌باشد. جالب توجه اينكه حتي الگوي بيان ژن تحت تيمار كوتاه ‌مدت و بلندمدت براي برخي ژن‌ها متفاوت مشاهده شد، اين مسئله بيانگر تغيير روند ملكولي در گياه طي مدت زمان‌‌هاي متفاوت اعمال تنش بر آن، در پاسخ به تنش هاست.

Introduction Plants continuously face several environmental and stressing factors. Among these factors, salinity, drought are the major environmental stimuli that can greatly influence plant growth and productivity. Plant water relations are disturbed by drought or high salinity due to the lowered water potential in the environment hampering water uptake or favouring loss of water from plants. These stresses impose osmotic stress on plants, causing a series of morphological, physiological, biochemical and molecular changes in plants. To survive these stresses, plants have evolved complex mechanisms to perceive external signals and to manifest adaptive responses with proper physiological, morphological and molecular changes (Zhu, 2002). In addition to, Closing of stomata reduces transpirational losses of water from leaves. The uptake and the biosynthesis of compatible solutes and the regulation of membrane permeability and transport are further measures that either hold back water within the plant or facilitate further uptake of water (Zhu, 2001; Sharp et al., 2004). AQPs are present in the tonoplast, the plasma membrane, and possibly in other internal membranes. In addition to water, individual MIP members may mediate the movement of small noncharged molecules, for example glycerol,urea, CO2, or formaldehyde(Tyerman et al., 2002; Gaspar et al., 2003; Uehlein et al., 2003). Furthermore, a role as osmotic or turgor sensors has been suggested for MIPs (Hill et al., 2004). Materials and methods Seeds of maize (Zea mays L. cv. SC. 704) were obtained from Urmia Agriculture Research Centre. Seeds were graded and the big uniform shaped ones selected. Seeds were surface sterilized with 2% sodium hypochlorite for 10 min then washed with sterile distilled water three times. Following vernalization, seeds were placed in growth chamber and transferred to the plastic pot containing a soil mixture of sand (30%) and compost (70%). Plant experienced the following growth conditions for 21 days: the light regime of 16/8 h light/dark with 80% humidity and 22°C temperature. After 21 days of culture, began treatment plants, were applied For short (4 days) and long (8 days) period treatment for three salinity stress NaCl(200mM), CaCl2(40mM) and drought PEG6000(10%). 21 dayoldmaize plants were divided into 8 groups and undergone following treatment for wounding and 4 and 8 days. Results and discussion The RTPCR result of all stressed leaves indicated no significant difference in PEG6000(10%) treatment in comparison to the others treatment. ZmPIP1,2 expression had been increased in NaCl4 , NaCl8, CaCl24 and especially CaCl28 plants compared to control plants. This indication showed the effect of salinity stresses (NaCl and CaCl2) on the ZmPIP1,2 suppression. Semiquantitative RTPCR analysis of ZmPIP1,5 gene expression showed significant reduction in NaCl8 plants while undergoing treatment of plants with CaCl24, PEG4 and PEG8 increase in gene expression observed. Other treated plants did not show significant changes in gene expression. Our results propose these genes are necessary for efficient sensing of environmental changes. Plasma membrane intrinsic proteins belonging to the aquaporin family have been reported to function in water transport in many plant species (Katsuhara et al., 2002; Chaumont et al., 2001; Tester and Bacic, 2005). Conclusions From the results of this experiment, it can be concluded that Semiquantitative RTPCR analysis of ZmPIPs genes expression in maize showed differential response and significant down or up regulation under applied adverse conditions. Further studies must be carried out to investigate the mechanism by which plant gene expression is controlled by abiotic stresses.