طراحي و ساخت وكتور خودكشي pDS132ΔkanR به منظور حذف ژن مقاومت به آنتي بيوتيك كانامايسين در بروسلا ملي‌تنسيس سويه Rev1 جهش‌يافته براي توليد سويه كانديد واكسن

Designing and Construction of the Suicide Vector pDS132ΔkanR to Delete Kanamycin Resistance Sequence in Mutant Strain of Brucella melitensis Rev1 Mutant Strain in order to Generate a Candidate Vaccine Strain

زمينه و اهداف: بروسلوز از مهم ترين بيماري هاي مشترك انسان و دام محسوب مي گردد. بهترين راه مقابله با بروسلوز انجام واكسيناسيون مناسب مي باشد. واكسن هاي موجود از قبيل واكسن Rev1 با معايبي چون سقط جنين در حيوانات باردار همراه است لذا تهيه واكسن مناسب براي درمان بروسلوز ضروريمي باشد. هدف از انجام اين مطالعه، طراحي و ساخت وكتور خودكشي pDS132DeltakanR به منظور حذف ژن مقاومت به آنتي بيوتيك كانامايسين در بروسلا ملي تنسيس سويه Rev1 جهش يافته براي توليد سويه كانديد واكسن بود. مواد و روش كار: در اين مطالعه براي حذف ترادف هدف، تصميم به استفاده از پلاسميد pDS132بهعنوان وكتور خودكشي گرفته شد. بمنظور ساخت كاست حذف، پس از طراحي و سنتز جداگانه قطعات داراي همولوژي با ترادف هاي هدف، اين قطعات جهت ساخت قطعه واحد، با استفاده از آنزيم هاي محدودگر مناسب در وكتور pBluescriptSK(-)كلونشد. سپس به منظور ساخت وكتور خودكشي، قطعه كاست حذف با استفاده از آنزيم هاي محدودگر مناسب از وكتور فوق جدا و در وكتور pDS132 ساب كلون شد. يافته ها: وكتور خودكشي pDS132ΔkanR با در برداشتن 590 جفت باز از توالي بالادست و 421 جفت باز از توالي پايين دست ترادف هدف مي تواند به عنوان يك ناقل خودكشي اختصاصي در ايجاد تداخل در ژن kanR در ژنوم باكتريبروسلا ملي تنسيس سويه Rev1 جهش يافته موجب حذف مقاومتآنتي بيوتيكي در آن بشود. نتيجه گيري: استفاده از سيستم خودكشي مورد نظر با استفاده از وكتور pDS132 Delta kanR، ايجاد جهش هدفمند را تسهيل و در مقايسه با ساير روش هاي خودكشي وابسته به ماركر مثبت و نيز روش هاي ابتدايي مانند پاساژ متوالي، روش موثرتري مي باشد.

Background and Aim: Brucellosis is a common disease between humans and animals. Vaccination is the best approach to prevent brucellosis. Existing vaccines such as Rev1 are associated with disadvantages such as abortion in pregnant animals. Therefore, it is necessary to generate an appropriate vaccine that is produced by molecular methods. The aim of this study was designing and construction of pDS132Δkanr suicide vector to delete kanamycin resistance sequence (kanR) in a mutant strain of Brucella melitensis rev1 to generate a candidate vaccine strain. Materials and Methods: In this study, the plasmid pDS132 was used as a suicide vector to delete target gene. In order to construct the deletion cassette, two homologous fragments were separately designed and constructed by PCR, and tandemly cloned into the pBluescriptSK() vector using appropriate restriction enzymes. Then, the deletion cassette was digested from the recombinant vector by terminal restriction enzymes, and sub cloned into the pDS132 vector to construct the suicide vector pDS132ΔkanR. Results: The pDS132ΔkanR contains 590bp upstream sequences and 421bp downstream sequences on the deletion cassette fragment; it can be used as specific suicide vector to disrupt the kanR sequence in genome of mutant strain of Brucella melitensis Rev1. Conclusions: The use of suicide pDS132ΔkanR system facilitated mutant construction which is a more specific and effective system in comparison with the other positive markerdependent suicide systems and primary techniques such as serial passages.