بررسي ميزان ترشح خارج سلولي پپتيد ضد سرطان VEGF111b در سلول هاي انساني HEK-293

Evaluation of anticancer peptide VEGF111b secretion in HEK293 human cells

سابقه و هدف: VEGF111b يك ايزوفرم جديد از فاكتورهاي رشد اندوتليال عروقي (VEGF) است كه اخيرا به عنوان يك داروي ضد سرطان مطرح شده است. هدف مطالعه حاضر بررسي ميزان ترشح اين پروتئين از ديواره سلول هاي HEK293 به منظور توليد تجاري اين فاكتور نوتركيب است. مواد و روش ها: توالي VEGF111b توسط نرم افزار OLIGO و اطلاعات ژن بانك NCBI طراحي و داخل وكتور pBUD.cE4.1كلون شد. وكتور نوتركيب pBUD.VEGF111b با استفاده از كيت ليپوفكتامين به داخل سلول هاي HEK293 ترانسفكت شد. توليد VEGF111b 48 ساعت بعد از ترانسفكشن در عصاره ليز سلولي توسط وسترن بلاتينگ و آنتي باديHuman anti-VEGF بررسي شد. ميزان ترشح VEGF111b در عصاره ليز سلولي و محيط كشت سلولي به روش ELISA اندازه گيري گرديد. نتايج: كلونيتگ صحيح قطعهVEGF111b در وكتور pBUD.cE4.1 توسط هضم آنزيمي و ژل الكتروفورز تائيد شد. مشاهده باند شارپ 12 كيلودالتن در نتايج وسترن بلات عصاره ليز سلولي نشان گر توليد پپتيد نوتركيب VEGF111b در سلول هاي HEK293 بود. نتايج الايزا در جذب نوري 450 نانومتر براي VEGF111bدر محيط كشت سلولي و عصاره ليز سلولي به ترتيب برابر با 2/81±19/20 pg/ml و pg/ml7/42± 32/87 بود. و در نمونه هاي كنترل منفي بيان VEGF-111b مشاهده نشد. نتيجه گيري: يافته هاي اين مطالعه نشان گر قابليت بالاي انتقال و ترشح VEGF111b از ديواره سلول هاي HEK293 به محيط كشت سلولي بدون شكستگي و هضم پروتئوليتيكي است. به نظر مي رسد توليد تجاري اين پپتيد دارويي و تخليص از محيط كشت سلولي HEK293 با بازدهي بالا امكان پذير باشد.

Background: VEGF111b is a new isoform of vascular endothelial growth factor (VEGF) recently considered as a new anticancer drug. The aim of this study was to evaluate the VEGF111b secretion from HEK293 cell wall in order to commercial production of this recombinant factor. Materials and Methods: After the design of VEGF111b sequence using OLIGO software and NCBI gene bank data, it was cloned into the pBUD.cE4.1 vector. The pBUD.VEGF111b recombinant vector was transfected into HEK293 cells using lipofectamine kit. Forty-eight hours after the transfection the production of VEGF111b was estimated by Western blotting and Human anti VEGF antibody. The VEGF111b secretion into cell culture and cell lysate extract was measured using ELISA. Results: The correct cloning of VEGF111b into pBUD.cE4.1vector was confirmed using enzymatic digestion and gel electrophoresis. The observed production of recombinant peptide in HEK293 was confirmed with 12KDa band in cell lysate extract of Western blotting. The ELISA results at 450 nanometer absorbance for cell culture media and cell lysate extract were 19.20±2.81 pg/ml and 32.87±7.42 pg/ml, respectively. However, no VEGF111b expression was observed in negative controls. Conclusion: The findings of this study indicate the powerful ability of transformation and secretion of VEGF111b from HEK293 cell wall to cell culture media with no breaking and proteolytic digestion. It seems that the commercial production and purification of this therapeutic peptide from HEK293 cell culture would be possible with high efficiency.