همسانه سازي و توالي يابي ژن‌هاي ويرولانسompA و smpA اسينتوباكتر باماني

Cloning and Sequencing of the ompA and smpA Virulence Genes of Acentobacter baumannii Isolated in Clinical Samples

چكیده زمینه و هدف: اسینتوباكتر بامانی یك پاتوژن نوظهور و مهم در بروز عفونت‌های مختلف از قبیل؛ عفونت دستگاه ادراری، بیمارستانی، مننژیت و دستگاه تنفسی می‌باشد. هدف از این مطالعه همسانه سازی و توالی یابی ژن­های ویرولانس ompA و smpA اسینتوباكتر بامانی بیماریزا می باشد. مواد و روش ها: در این مطالعه نیمه تجربی، سویه بیماریزای اسینتوباكتر بامانی بر روی محیط‌های بلاد آگار و مك كانكی آگار كشت داده شد. تشخیص و تأیید اسینتوباكتر بامانی به روش­های میكروسكوپی، كشت میكروبی و بیوشیمیایی انجام شد. دو ژن ompA و smpA با تكنیك PCR تكثیر و درون وكتور پلاسمیدی pTZ57R/T كلون شدند. صحت سازواره نوتركیب به دو روش PCR و هضم آنزیمی‌ دوگانه انجام شد. دو ژن ompA و smpA  كلون شده در پلاسمید pTZ57R/T توالی یابی شدند. سپس ژن­های ompA و smpA درون وكتور پروكاریوتی ساب كلون گردیده و بیان آنها در باكتری اشرشیا كلی به روش SDS-PAGE  بررسی شد.   یافته‌ها: سویه بیماریزای اسینتوباكتر بامانی با روش های بیوشیمیایی و میكروبیولوژی تایید شد. از الكتروفورز محصولات PCR دو باند 1150 و 411 جفت بازی به دست آمد كه به ترتیب مربوط به ژن‌های ompA و smpA بود. نتایج انجام PCR و هضم آنزیمی دوگانه روی پلاسمیدهای نوتركیب، درستی تشكیل pTZ57R/T-ompA و pTZ57R/T-smpA را نشان داد. نتایج تعیین توالی، صحت كلون سازی را مشخص نمود.   نتیجه‌گیری: نتایج به دست آمده نشان داد كه پلاسمیدpTZ57R/T برای كلون سازی قطعات بزرگDNA مناسب می‌باشد و با توجه به حفاظت شدگی بالای دو ژن ompA و smpA  برای ساخت واكسن می‌توان از آنها استفاده نمود.     

Abstract Background and aim: Acinetobacter baumannii is one of the emerging and important pathogens in various infections such as urinary tract infection, hospitals, meningitis and respiratory tract. The aim of this research is cloning and sequencing of ompA and smpA virulence genes of A. baumannii.   Methods: In this experimental study, the pathogenic A. baumannii was cultured on blood agar and macconkey agar mediums. Recognition of A. baumannii with microscopic, microbiologic and biochemical tests were performed. ompA and smpA genes were amplified by PCR and then cloned into the pTZ57R/T vector. The accuracy of the recombinant construct was carried out with PCR and enzymatic double digestion and then the both of ompA and smpA genes were sequenced. The evaluation of bacterial expression of these genes was performed with SDS-PSGE method in E. coli.   Result: The pathogenic A. baumannii was confirmed in biochemical and microbiological methods. After electrophoresis of the PCR products, the 1150 and 411 bp fragments of ompA and smpA genes were obtained, respectively. The results of PCR and double digestions on recombinant plasmids showed that the pTZ57R/T-ompA and pTZ57R/T-smpA were generated. The sequencing results confirmed the accuracy of the gene cloning.   Conclusion: The results showed that the pTZ57R/T is a suitable vector for the cloning of large fragment of PCR products and ompA and smpA are two highly conserved genes that appropriate for use as DNA vaccine.