رديابي ويروييدهاي مركبات با روش استخراج اسيد نوكلييك توسط CF-11

Detection of Citrus Viroids by CF-11 Nucleic Acid Extraction Method

بيماري‌هاي كاچكسيا ناشي از ويروييدCitrus Cachexia viroid, CCaVd و اگزوكورتيس ناشي از ويروييد Citrus exocortis viroid, CEVd مهم‌ترين بيماري‌هاي ويروييدي مركبات در جهان هستند. ويروييدها با روش‌هاي متداول سرولوژيكي قابل شناسايي نبوده و روش‌‌هاي فعلي تشخيص آنها عموماً وقت‌گير، پر هزينه و با محدوديت‌‌هايي همراه است. در اين بررسي امكان خالص‌سازي و شناسايي دقيق اين ويروييدها با استفاده از ستون كروماتوگرافيCF-11 بررسي شد. طي سال‌هاي1390 تا 1392، از سرشاخه‌هاي22 درخت نارنگي و 15 درخت پرتقال به ترتيب واجد علايم بيماري‌هاي كاچكسيا و اگزوكورتيس در شرق مازندران نمونه برداري شد. بافت برگ پس از پودر شدن با بافر استخراج مخلوط شد. خالص‌سازي در ستون حاوي پودر سلولز انجام و با افزودن اتانول، مولكول‌هاي آر ان اي دو رشته‌اي استخراج و توسط استات سديم رسوب داده شد. رسوب حاصل در آگارز يك درصد الكتروفورز و دو باند اختصاصي در محدوده‌هاي 300 تا 400 جفت باز (فرم خطي) و7800 -7000 جفت باز (فرم حلقوي) مرتبط با اين دو ويروييد به دست آمد كه به ترتيب در ماه‌هاي گرم و در تمامي ماه‌هاي سال با اين روش قابل‌شناسايي بود. ماهيت RNA دورشته‌اي باندهاي به ‌دست آمده، با عدم تخريب آنها توسط آنزيم ‌DNase وهمچنين RNase در حضور محلول نمك طعام 3/0 مولار و حلاليت آن‌ها در محلول LiCl تاييد شد. ماهيت ويروييدي باندهاي به دست آمده توسط واكنش زنجيره‌اي پلي مراز (RT-PCR) با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي CEVd و CCaVd تعيين گرديد. تعداد 500 نهال پرتقال و 300 نهال نارنگي در آزمون سلامت نهال با اين روش بررسي شد.با توجه به تكرار پذيري و قابل اعتماد بودن اين روش و تاييد ماهيت باندهاي به دست آمده با آغازگر اختصاصي هر يك از اين دو ويروييد در واكنش زنجيره اي پلي‌مراز، اين روش براي تشخيص ويروييدهاي مركبات در برنامه‌هاي كاربردي توليد نهال سالم با صرف حداقل زمان و هزينه پيشنهاد مي‌گردد.

Cachexia (Citrus cachexia viroid, CCaVd) and exocortis (Citrus exocortis viroid, CEVd) are the most important citrus viroid diseases in the world. Detection of the viroids through the common serological methods is not feasible and the current methods are time consuming and costly with some limitation. Purification and accurate detection of the viroids was studied by column chromatography with CF-11 cellulose powder in presence of ethanol (common method for viruses’ dsRNA detection) in comparison to the conventional methods. During 2010-2012, sampling was done from twigs of 22 Mandarin and 15 orange trees have symptoms of cachexia and exocortis, respectively, in East Mazandaran. Leaf samples were ground and mixed with extraction buffer. Purification carried out in CF-11 column and viroid molecules extracted with ethanol and precipitated by adding sodium acetate. The nucleic acid extracts were analyzed by 1% agarose gel electrophoresis and specific bands of the two viroids with molecular sizes of 7000-7800bp (circular form) and 300-400bp (linear form) were detected in warm and all months, respectively. The dsRNA nature of the bands was confirmed by nuclease treatment (DNaseI and RNaseA) and 2M LiCl extraction methods.Viroid entity of the each nucleic acid sample was recognized by RT-PCR method using specific primers of cachexia and exocortis viroids. 500 orange and 300 mandarin seedlings were tested in healthy citrus seedling production program.As regards of advantages of this method (repeatability, reliability, saving time and price) and confirmation by RT-PCR, the method is recommended for viroid detection in healthy citrus seedling production programs.