تأثير هورموني و ريزنمونه بر كالزايي، باززايي و كشت سوسپانسيون سلولي در رازيانه (Foeniculum vulgare Mill.)

The effects of plant growth regulators and explants on callogenesis, regeneration and suspension culture in Foeniculum vulgare Mill.

به منظور بررسی تأثیر تیمارهای هورمونی بر كالزایی و باززایی در گیاه رازیانه، پنج ریزنمونه (برگ، هیپوكوتیل، مریستم انتهایی، ریشه و طوقه) انتخاب شد. بذر گیاه رازیانه بعد از استریل به محیط آب در لوله آزمایش روی پل كاغذی كشت و در دمایoC24 با 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریكی قرار داده شد و بعد از گذشت 15 روز كه گیاه به ارتفاع حدود 10 سانتی‌متر رسید ریزنمونه‌ها تهیه شدند. القای كالوس با كشت ریزنمونه‌ها روی محیط  MS½ با 9 تیمار هورمونی شامل هورمون 2,4-D (2، 4 و 8 میلی‌گرم در لیتر) و BAP (25/0، 5/0 و 1 میلی‌گرم در لیتر) تحت شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریكی و دمای oC24 انجام شد. اندازه كالوس، وزن كالوس و درصد كالزایی در هر یك از تیمارهای بكار رفته اندازه‌گیری شد. با درنظر گرفتن صفات فوق هورمونی 2 و 4 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 25/0 و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP بهترین تركیبهای هورمونی و نیز هیپوكوتیل و مریستم انتهایی بهترین ریزنمونه‌ها شناخته شدند. در مرحله باززایی كالوس محیط  MS½ با 9 تركیب هورمونی یاد شده به همراه 2,4-D (2/0 میلی‌گرم در لیتر) و BAP (5/0، 2، 4، 15، 20 و 25 میلی‌گرم در لیتر) و TDZ (15 و 20 میكرولیتر) و محیط  MS½ بدون هورمون در نظر گرفته شد كه محیط MS ½ بدون هورمون بهترین محیط باززایی را نشان داد. به منظور مطالعه تولید اسانس در فاز كشت سوسپانسیون سلولی بهترین تیمار در فاز كالزایی انتخاب شد و كالوس به محیط سوسپانسیون سلولی به محیط كشت MS ½ شامل 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر) و BAP (25/0 میلی‌گرم در لیتر) منتقل و در شرایط تاریكی در دمای oC24 روی شیكر با 100 دور در دقیقه قرار داده شدند. بعد از 4 هفته طیف‌نگاری جرمی انجام شد كه تولید موادی همچون آلفا-پینن و لیمونن در محیط كشت بافت گزارش شد.

Seeds were cultured on Whatman paper by sterile water in cube, solid MS and solid MS. Seeds were not germinated on medium but 80% of seeds were germinated on Whatman paper, so this method is used as a basic method. Seeds were germinated after four days and after two weeks of culture they had normal roots, shoots and leaves. Cultures were incubated at 25◦ ±2◦C and exposed to 16 hours light per day. Explants were cultured on MS medium supplemented with 3% sucrose and solidified with 0.8% (w/v) agar. The pH of the medium was adjusted to 5.8 before autoclaving. Different types of explants were used for this experiment; root, crown, apical meristem, hypocotyls and leaf. Between different kinds of explants leaf didn’t response to callogenesis. The effects of different combinations of 2,4-D (2,4-Diclorophenoxy acetic acid) and BAP (6-Benzylaminopurine) were studied. Subculture was done every 3 weeks. In order to determine regeneration ability, the initiated callus were transferred to a regeneration medium which was composed of macronutrient, micronutrient and organic components of MS, 2,4-D (0.2 mgL-1), BAP (0.5, 2, 4, 15, 20 and 25 mgL-1) and MS without hormones, 0/3% sucrose, pH 5.8 for 4 weeks. In the presence of 2,4-D (2 and 4 mgL-1) and BAP (0.25 and 0.5 mgL-1) in the callus induction medium, high callus production percentage was reported. The hypocotyls, in contrast to the primary leaf explants, and apical meristem segments were more responsive to the tested combinations of 2,4-D and BAP. The callus from all explants was soft, watery and loose friable. During subculture period, hypocotyls and apical meristem were proliferated more on medium with the addition of (0.25 and 0.5 mgL-1) BAP and (2 and 4 mgL-1) 2,4-D than the medium contain BAP (1 mgL-1) and 2,4-D (8 mgL-1). The present study, in F. vulgare MS media without any hormone was sufficient to regenerate the plantlet from the hypocotyls, roots and apical meristems explants. In MS medium supplemented with BAP (0.5, 2 and 4 mgL-1) and 2,4-D (0.2 mgL-1) shoots were formed earlier when the number of subculture was increased 4 times.