زيست پالايي جيوه معدني از طريق ساخت وكتور نوتركيب pET 21a(+)-merA

Bioremediation of mineral mercury via construction of recombinant vector pET21a(+)-merA

سابقه و هدف: ورود جيوه معدني از طريق صنايع و كشاورزي به محيط زيست يكي از جدي ترين مشكلات زيست محيطي در كشور به شمار مي آيد. زيست پالايي توسط باكتري ها يكي از راهكارهاي مناسب و عملي براي پاكسازي آلاينده ها از محيط محسوب مي گردد. مطالعه حاضر با هدف ساخت وكتور نوتركيب حاوي ژن merA و نيز بررسي بيان آن به منظور پاكسازي جيوه انجام گرديد. مواد و روش ها: ابتدا ژن merA از ژنوم باكتري مقاوم به جيوه جداسازي و در داخل وكتور بياني pET21a(+) كلون گرديد. صحت همسانه سازي ژن مورد نظر از طريق واكنش PCR و هضم آنزيمي مورد تاييد قرار گرفت. وكتور نوتركيب pET21a(+)-merA به درون باكتري اشريشيا كلي سويه BL21 كلون شد. براي مشاهده افزايش مقاومت به جيوه معدني در باكتري تراريخته و عملكردي بودن آنزيم توليدي از وكتور نوتركيب، ميزان رشد باكتري هاي اشريشيا كلي سويه BL21حاوي وكتور نوتركيب به همراه باكتري هاي اشريشيا كلي سويه BL21 فاقد ژن merA در محيط حاوي جيوه معدني در مدت 48 ساعت اندازه گيري شدند. يافته ها: نتايج نشان داد كه رشد باكتري اشريشيا كلي حاوي وكتور بدون ژن هدف تا 12 ساعت پس از ريختن جيوه به شدت تحت تاثير محيط حاوي جيوه قرار گرفته و قادر به رشد در مقادير 10 و ppm 20 جيوه نمي باشند. در حالي كه باكتري حاوي وكتور نوتركيب pET21a(+)-merA داراي قابليت رشد خوبي در محيط حاوي جيوه بودند. SDS-PAGE پروتئين هاي باكتري حاوي وكتور نوتركيب بر روي ژل آكريل آميد نشان داد كه بيشترين بيان پروتئين MerA (با اندازه kDa 62)، پس از 16 ساعت القا با IPTG يك ميلي مولار در دماي 37 درجه سليسيوس به دست مي آيد. نتيجه گيري: در مجموع توانايي رشد باكتري هاي اشريشيا كلي حاوي وكتور نوتركيب، نشان دهنده عملكرد پروتئين MerA در باكتري هاي تراريزش شده مي باشد. همچنين افزايش مقاومت باكتري نوتركيب به جيوه معدني موجود در محيط بيانگر اين موضوع است كه مي توان آلاينده هاي فلزات سنگين در محيط زيست را با مديريت مناسب از طريق ساخت وكتور نوتركيب پاكسازي نمود.

Background & Objectives: Inorganic mercury entrance into the environment through industry and agriculture is one of the most serious environmental hazards in the country. Microbial bioremediation is considered as one of the practical solutions to clean up pollutant ions from the environment. The present study was conducted to construct a recombinant vector including merA gene, and also to investigate its expression in order to clean up mercury. Material & Methods: merA gene from mercury resistance bacterial genome was isolated, and subsequently cloned into the pET21a(+) expression vector. Confirmation of cloning target gene was achieved by PCR and restriction enzyme digestion. Then pET21a(+)-merA recombinant vector was cloned into E.coli strain BL21. In order to assess increased resistance to mercury in recombinant bacteria, and the functionality of the enzyme produced by the recombinant vector, the growth rate of recombinant BL21 E. coli strains to contain merA gene, and without it was measured in a medium containing mercury for 48 hours. Results: The results showed that the growth of E. coli strains without merA gene was strongly affected after introducing mercury into the media till 12 hours, and bacteria would not be able to grow at 10 ppm and 20 ppm mercury levels. However, transformed bacteria with pET21a(+)-merA vector showed suitable growth in mercury-containing media. SDS-PAGE analysis of recombinant bacterial proteins on acrylamide gel showed the highest MerA (62KDa) expression following 16 hours induction with 1mM IPTG at 37ºC. Conclusion: Overall, the growth ability of merA- containing recombinant bacteria reflects the action of MerA protein in transformed bacteria. Furthermore, increasing the resistance of recombinant bacteria to the mercury indicates that environmental heavy metal pollutants can be cleaned up properly through the construction of recombinant vectors.