تخليص و بررسي ويژگي هاي آنتي ژنيك پروتيين پوششي ويروس موزاييك خيار بيان شده در باكتري Escherichia coli

چكيده تخليص انواع پروتيين هاي بيان شده ي ويروسي با اهداف مختلف از جمله توليد آنتي بادي هاي چند همسانه اي و تك همسانه اي، مطالعه ي ساختاري آنها، شناسايي توالي آمينو اسيدي و توالي پپتيدي با استفاده از انواع روش هاي كروماتوگرافي، صورت مي پذيرد كه عموماً كاربرد چنين روش هايي مستلزم صرف هزينه ي زياد مي باشد. در اين تحقيق سعي شد پس از بيان ژن پروتيين پوششي ويروس موزاييك خيار، تخليص و خالص سازي پروتيين بيان شده مورد نظر از ژل پلي آكريل آميد انجام پذيرد. در همين راستا، پس از بيان ژن پروتيين پوششي ويروس موزاييك خيار در باكتري Escherichia coli، الكترفورز پروتيين هاي استخراج شده از باكتري در ژل پلي آكريل آميد صورت گرفت كه نتايج بدست آمده حاكي از توليد مطلوب پروتيين براي استخراج از ژل بود. پس از بيان ژن مورد نظر در حجم زياد، پروتيين بيان شده در باكتري روي ژل پلي آكريل آميد الكترفورز گرديد. پس از الكترفورز و تعيين محل نوار پروتيين بيان شده، محل مورد نظر از ژل بريده و تخليص گرديد. سپس، پروتيين تخليص شده از ژل به منظور ايمني زايي به خرگوش تزريق شد و سرم ايمن شده پس از سپري شدن زمان مناسب استحصال شد و عيار آن مشخص گرديد. اين روش با توجه به هزينه و امكانات قابل دسترس، در مقايسه با ساير روش هاي تخليص از جمله كروماتوگرافي، كم هزينه و كارا مي باشد. همچنين نتايج ديبا و وسترن بلات با استفاده از پروتيين تخليص شده و ايمن زايي خرگوش نشان داد كه از اين پروتيين ميتوان به منظور توليدآنتي سرم و آنتي بادي براي رديابي ويروس موزاييك خيار استفاده نمود. واژه هاي كليدي: آنتي بادي، تخليص، پروتيين پوششي، نوتركيب، ويروس موزاييك خيار

Abstract Purification of expressed proteins is done to pursue different goals such as preparation of mono- and polyclonal antibodies, structural studies of the expressed proteins, identification of the amino acids and polypeptide sequences by chromatography which are generally costly and time- consuming. In this research, after expression of the coat protein (CP) gene of Cucumber mosaic virus (CMV) in Escherichia coli, purification of the expressed protein was done from polyacrylamide gel. To this aim, recombinant plasmid containing the CP gene was transformed into E. coli, induced by Isopropyl B-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) and followed by polyacrylamide gel electrophoresis of the extracted protein. The result showed that the yield of the recombinant protein was optimized to purification. After express the recombinant plasmid in large volume of LB, extracted protein was electrophoresed on the polyacrylamide gel. The location of the expressed protein was determined, and then the expected protein band was separated from the polyacrylamide gel before subjecting to protein purification. Next, the recombinant purified protein was injected to two rabbits to raise the antiserum. Titration of the prepared antiserum was performed by the use of an indirect ELISA. It appeared that the method applied in this study to purify the expressed protein was more efficient than other purification methods such as chromatography. Also, results of DIBA and rabbit immunization showed that the purified protein could be used as the antigen to prepare the antiserum and antibody for detection of the CMV isolates. Keywords: Cucumber mosaic virus, Coat Protein, Polyacrylamide gel, Recombinant antibody.