توليد گياه توتون مقاوم به ويروس PVX با استفاده از مكانيسم RNA Silencing

چكيده يكي از مهم ترين ويروس هاي بيماري زاي خانواده سولاناسه ويروس (PVX)Potato X virus مي باشد كه سبب ايجاد لكه هاي موزاييك سيستميك در توتون (Nicotiana tabacum L.) و خسارت اقتصادي به آن مي شود. بهترين روش مديريت اين بيماري استفاده از ارقام مقاوم توتون است. در اين تحقيق جهت ايجاد گياهان توتون مقاوم به PVX ابتدا سازه سنجاق سري قطعه اي 400 نوكلوتيدي از ژن P25 اين ويروس كه ممانعت كننده از RNA Silencing در گياه است، ساخته شد. براي اين كار قطعه ژن P25 به روش PCR با آغازگرهاي اختصاصي تكثير و در دو مرحله، در دو جهت سنس و آنتي سنس در ناقل pFGC5941 همسانه سازي شد. در مرحله بعد، سازه RNAi از روي اين ناقل نوتركيب به واسطه آگروباكتريوم، به ريزنمونه هاي (قطعات برگ) گياهان توتون رقم سامسون انتقال يافت و گياهان تراريخته با گزينش روي محيط كشت حاوي بستا بدست آمده كه پس از تكثير مورد بررسي-هاي فنوتيپي و مولكولي قرار گرفتند. بررسي مولكولي با PCR روي DNA گياهان، وجود تراژن را تاييد كرد. نسل بعدي گياهان تراريخته در گلخانه به روش مكانيكي با PVX تلقيح شدند. نتايج ELISA با آنتي بادي اختصاصي پروتيين پوششيPVX مقاومت سه لاين تراريخته را نشان داد. تاييد مولكولي اين سه لاين مقاوم توتون به PVX با استفاده از RT-PCR روي RNA استخراج شده از گياهان به كمك آغازگرهاي CP ويروس انجام شد و ويروس در گياهان تراريخت رديابي نگرديد. نتيجه اين تحقيق منجر به توليد سه لاين مستقل توتون مقاوم به PVX شد كه بررسي مقاومت آنها در شرايط مزرعه در حال انجام مي باشد. واژه هاي كليدي: توتون، ويروس PVX، مقاومت، گياه تراريخته، RNA Silencing.

Abstract One of the most pathogenic viruses in Solanaceous plants is Potato X virus (PVX) which causes systemic mosaic spots and economic loss in Nicotiana tabacum. Use of the tobacco resistance varieties is the best method in management of this disease. In this study, to establish the tobacco plants resistant to PVX, an RNAi construct was designed for a 400 bp fragment of PVX’s P25 gene which is a suppressor of RNA Silencing in plant. The P25 fragment was amplified with specific primers by PCR and was cloned in two steps (in sense and antisense directions) into the pFGC5941 plasmid. Then, the RNAi construct was transformed from recombinant plasmid into the tobacco explants (Samsun) by means of Agrobacterium cells. The transgenic plants were identified by selection on Basta containing media and propagated, followed by molecular and phenotypic analyses. PCR test using plant’s DNA confirmed the presence of the transgene in transgenic plants. The next generation of the transgenic plants was inoculated with PVX in greenhouse. ELISA using anti-PVX-CP antibody showed that three transgenic lines are resistant to PVX. Molecular confirmation of three tobacco resistant lines was performed by RT-PCR using plant RNA and CP-specific primers and PVX did not detected in transgenic plants. This study resulted in production of three tobacco lines resistant to PVX. Study of their resistance in the field condition is in progress. Keywords: PVX, Resistance, RNA Silencing, Tobacco, Transgenic Plant.