بررسي اثر كامفور بر بيان ژن‏هاي INT1 و EFG1 در كانديدا آلبيكنس در سه زمان تيمار 24، 48 و 72 ساعت با روش Real Time PCR

A Survey of the Effect of Camphor on INT1 and EFG1 Gene Expressions of Candida albicans at Three Treatment Times (24, 48, and 72 hours) via Real-time PCR

هدف: كانديدا آلبيكنس مخمر فرصت طلبي است كه در افراد داراي نقص سيستم ايمني و در شرايط مناسب، به حالت بيماري‏زا مبدل مي‏شود. مواد تشكيل دهنده گياهان دارويي مانند كامفور مي‏توانند بيان ژن‏هاي دخيل در ويرولانس قارچ‏ها را به واسطه خواص ضد قارچي خود، كاهش دهند. محصول ژن‏هاي INT1 و EFG1 نقش مهمي در چسبندگي كانديدا آلبيكنس به بافت ميزبان و هيفي شدن آن ايفا مي‏كنند كه اين خصوصيات مي‏تواند از عوامل بسيار مهم بيماريزايي آن ‏باشند. مطالعه حاضر به بررسي اثر كافور بر تغييرات بيان ژن‏هاي INT1 و EFG1 در سه زمان تيمار 24، 48 و 72 ساعت با استفاده از Real time PCR پرداخته است. مواد و روش‏ها: رقت‏هاي سريالي از كامفور در غلظت‏هاي 512، 256، 128، 64، 32، 16، 8، 4، 2 و 1 ميلي‏گرم در هر ميلي‏ليتر تهيه شد و سپس سوسپانسيون سلولي كانديدا آلبيكنس سويه ATCC 10231 با غلظت 103×5/1 سلول در ميلي‏ليتر به‏مدت 48 ساعت در 35 درجه سانتي‏گراد با آن تيمار شد. سپس حداقل غلظت مهاركننده 50 درصد و 90 درصد (MIC50/90) رشد قارچ و حداقل غلظت كشنده قارچ (MFC) اين تركيب به روش رقت ميكروبراث تعيين شد. كانديدا آلبيكنس به‏مدت 24، 48 و 72 ساعت با كامفور در حداقل غلظت مهاركننده 50 درصد رشد قارچ (MIC50) تيمار شد. استخراج RNA مخمرها قبل و بعد از مجاورت با اين تركيب صورت گرفت، سپس ترجمه معكوس به cDNA و در نهايت ارزيابي به كمك Real time PCR انجام شد. نتايج: حداقل غلظت مهاركننده 50 درصد رشد قارچ (MIC50)، حداقل غلظت مهاركننده 90 درصد رشد قارچ (MIC90) و حداقل غلظت كشنده قارچ (MFC) براي كامفور به ترتيب 16، 32 و 64 ميلي‏گرم در هر ميلي‏ليتر تعيين شد. بررسي تغييرات بيان اين ژن‏ها در مخمر نيز نشان داد كه كامفور بيان ژن INT1 را در زمان 24 ساعت پس از تيمار به ميزان 87 درصد، 48 ساعت پس از تيمار 97 درصد و 72 ساعت پس از تيمار 86 درصد نسبت به نمونه تيمار نشده كاهش داده است. اين موضوع در خصوص ژن EFG1 نيز نشان داد كه بيان اين ژن در تيمارهاي 24 ساعتي با كامفور به ميزان 58 درصد، در تيمارهاي 48 ساعتي 93 درصد و در تيمارهاي 72 ساعتي 49 درصد كاهش داشته است. نتيجه‏گيري: در سال‏هاي اخير به دنبال بروز مقاومت‏هاي دارويي و بروز عوارض جانبي داروهاي شيميايي، استفاده از گياهان دارويي افزايش يافته است. اين گياهان ممكن است بتوانند به‏عنوان عوامل ضد قارچي كارآمد عمل نمايند. نتايج اين پژوهش نشان داد كه استفاده از تركيبات خالص شيميايي موجود در ساختار اين گياهان مانند كامفور، مي‏تواند به‏طور چشمگيري در كاهش بيان ژن‏هاي ويرولانس قارچي از جمله INT1 و EFG1 تاثير داشته باشد.

Objective: Candida albicans (C. albicans) is an opportunistic yeast that can lead to pathogenesis in immunocompromised individuals and under suitable conditions. Medicinal plants ingredients such as camphor can reduce the expressions of genes involved in virulence of the fungi through their antifungal properties. The products of INT1 and EFG1 are implicated in inducing filamentous growth and adhesion of C. albicans to the host tissues. Both of these characteristics are very important in its virulence. The present study focuses on the evaluation of the effects of camphor on INT1 and EFG1 expressions at three time points of treatment (24, 48, and 72 hours) via real-time PCR. Methods: We prepared serial dilutions of camphor (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, and 512 mg/ml) and co-cultured them with 1.5×103 cells/ml of a C. albicans ATCC 10231 suspension for 48 hours at 350C. Next, we determined the MIC50/90 and MFC. C. albicans cells were treated with the MIC50 concentration of camphor for 24, 48, and 72 hours. RNA from C. albicans was extracted before and after treatment, back translated into cDNA, and analyzed with real-time PCR. Results: MIC50, MIC90 and MFC of camphor were determined at 16 mg/ml, 32 mg/ml and 64 mg/ml, respectively. Evaluation of gene expression changes in yeast showed that camphor reduced the INT1 gene expression about 87% at 24 hours, 97% at 48 hours, and 86% at 72 hours after treatment compared to the untreated sample. EFG1 expression reduced about 58% at 24 hours, 93% at 48 hours, and 49% at 72 hours after treatment with camphor. Conclusion: In recent years, advancements have been seen in herbalism due to the increased drug resistance and adverse effects of chemical drugs. These plants may efficiently act as antifungal agents. The results of this study have shown that the use of camphor can significantly reduce the expression of virulence genes INT1 and EFG1 in C. albicans.