روشي ساده براي تخليص ساب كلاس IgG2a موشي با كمك كروماتوگرافي تعويض يوني و افينيتي كروماتوگرافي

A simple method for purification of mouse igg2a by ion exchange and affinity chromatography

زمينه: هدف از اين مطالعه تخليص ساب كلاس IgG2a موش مي باشد محصولي كه براي ايمونيزاسيون حيوانات ديگر جهت توليد هيبريدوماها در پروسه توليد آنتي باديهاي مونو كلونال و توليد آنتي باديهاي پلي كلونال به كار مي رود. روش كار: در قدم نخست كروماتوگرافي تعويض يوني (Ion exchange chromatography) براي تخليص IgG موش و در مرحله بعد افينيتي كروماتوگرافي با پروتئين ProA) A) براي تخليص ساب كلاس IgG2a موش به كار برده شد. بعد از هر مرحله تخليص روش الكتروفورز SDS-PAGE براي تاييد خالص سازي به كار رفت. در مرحله آخر تاييد ساب كلاس آنتي بادي خالص شده با كمك كيت تعيين ايزوتايپ صورت گرفت. يافته ها: رسوب ايمونوگلوبولين هاي موشي با غلظت mg/ml 27 به مقدار 3 سي سي روي ستون افينيتي كروماتوگرافي Ion exchange برده شد. مقدار محصول IgG از ستون تعويض يوني Ion exchange) ) 28 ميلي گرم و مقدار محصول IgG2a ستون ProA، 8 ميلي گرم بود. در نتايج الكتروفورز SDS-PAGE در حالت احيا دو باند در موقعيت وزن مولكولي 25 و 50 كيلودالتون( KDa) مشاهده شد. تعيين ايزوتايپ محصول به دست آمده وجود IgG2a با زنجيره سبك كاپا را تاييد كرد. نتيجه گيري: در اين مطالعه محصول IgG2a با خلوص بالاي 95% به دست آمد. خلوص بالاي محصول به دست آمده نشان مي دهد كه كروماتوگرافي تعويض يوني و به دنبال آن كروماتوگرافي با ProA روش مناسبي براي تخليص ساب كلاسهاي IgG موش با كيفيت و خلوص بالا مي باشد. توليد اين محصول مناسب و اقتصادي با درجه خلوص بالا قدمي به سوي اسقلال كشور است.

Background: Purified mouse IgG2a (a product that could be used in medical research) subclass could be used for animal immunization to production of polyclonal Antibody and to obtain hybridomas in Monoclonal Antibody Production Procedures. The goal of this study was to purify the mouse IgG2a. Methods: In one step، Ion exchange chromatography was carried out for purification of mouse IgG and then in second step، ProA affinity chromatography was used for IgG2a purification .The chosen method for determination of purity was reduced and non-reduced SDS-PAGE. ELISA method was used for titer and isotype determination. Results: Mouse Igs with a protein concentration of 27mg/ml (volume: 3CC) was applied on Ion exchange column. Purification by Ion exchange chromatography yielded about 28mg of mouse IgG. Eight mg mouse IgG2a was obtained by ProA affinity chromatography. In reduced SDS-PAGE analysis of purified antibody، two bands were seen in 25& 50 KDa MW positions. Isotype determination of purified mouse IgG2a with mouse isotyping Kit showed the presence of mouse IgG2a isotype with a kappa light chain in related fraction. Conclusion: Purified mouse IgG2a subclass was obtained with purity more than 95%. Due to the obtained high purity we concluded that Ion exchange chromatography following by ProA affinity chromatography could be a suitable method for purification of mouse IgG subclasses with high quality. Our product is an economical and suitable product that takes a step towards self-sufficiency of the country.