افزايش بيان ژن آنزيم p-كومارات 3-هيدروكسيلاز و تركيبات فنيل پروپانوئيدي تحت تاثير كيتوزان در كشت سلولي گل ميموني سازويي (Scrophularia striata)

Increasing of p-coumarate 3-hydroxylase gene expression and phenylpropanoid compounds of Scrophularia striata by chitosan

كيتوزان از تركيبات اصلي ديواره سلولي بسياري از گونه هاي قارچي است كه به عنوان اليسيتور زيستي در بهبود بيوسنتز متابوليت هاي ثانوي استفاده مي شود. هدف از اين مطالعه بررسي اثر كيتوزان بر رشد، توليد تركيبات فنيل پروپانوئيدي ( فنل كل، پلي فنل اكيناكوزيد، فلاونول كل و فلاونوئيدها) و بيان ژن آنزيم p-كومارات 3-هيدروكسيلاز (C3H) در طول دوره زماني بعد از اعمال تيمار است. در اين پژوهش، سلول ها با غلظت 10 ميلي گرم در ليتر كيتوزان تيمار و در بازه زماني 3، 5 و 7 روز پس از اعمال اليسيتور برداشت شدند. سنجش اكيناكوزيد توسط كروماتوگرافي مايع با فشار بالا (HPLC) و اندازه گيري ساير تركيبات فنيل پروپانوئيدي با روش اسپكتروفتومتري انجام شد و سطح بيان ژن نيز با روش Semi-quantitative RT-PCR بررسي شد. تيمار سلول هاي گل ميموني سازويي با كيتوزان سبب كاهش رشد سلولي و افزايش معني داري در محتواي اكيناكوزيد در تمامي روزهاي بعد از اعمال تيمار نسبت به سلول هاي شاهد شد و ميزان بيشينه اكيناكوزيد 5 روز پس از اعمال تيمار حاصل شد (5.7 برابر شاهد). ميزان فنل كل، فلاونول كل و فلاونوئيدها از ابتدا تا انتهاي دوره زماني، تحت تاثير كيتوزان نسبت به سلول هاي شاهد افزايش يافت. بيان ژن آنزيم C3H، پس از افزودن كيتوزان القاء شد و اوج ميزان آن پس از گذشت 5 روز از اعمال تيمار مشاهده گرديد (2 برابر شاهد). كيتوزان با تاثير بر بيان ژن آنزيم كليدي مسير بيوسنتزي تركيبات فنيل پروپانوئيدي، سبب فرا تنظيمي توليد اين تركيبات از جمله اكيناكوزيد مي شود.

Chitosan is the main compounds of fungal species cell walls and as biotic elicitors could be used to improve secondary metabolites. In this study, we have verified the time-course of cell growth, phenylpropanoid compounds ( total phenol, flavonols, flavonoids and echinacoside) production in cells treated with chitosan. To study mechanism of chitosan action, expression of p-coumarate 3-hydroxylase (C3H) gene was investigated. The cells were treated with 10 mg/L chitosan. Cells were harvested for 3,5 and 7 days after elicitation. Echinacoside quantified by high-performance liquid chromatography (HPLC) and other phenylpropanoid compounds were measured with spectrophotometric assay. Cells samples were used to elucidate the expression level of C3H gene by Semi-quantitative RT-PCR. Following treatments with chitosan, the results showed that the cell growth and viability of cells were decreased as compared to control. In addition, chitosan increased total phenol, flavonoids and flavonols. Cells elicited with chitosan for 5 days yielded the highest amount of echinacoside wich was about 5.7-fold higher than control. The expression of gene by chitosan was increased, reaching a peak at 5 day after treatment (2-fold higher than control). Chitosan up-regulate the production of phenylpropanoid compounds and derivates such as echinacoside, by effecting on gene expression of this compounds biosynthesis pathway.