همسانه سازي و بيان ژن نوتركيب CD40L انساني در رده سلولي HEK293

Cloning and Expression of Recombinant Human CD40L in HEK293 Cell line

سابقه و هدف: CD40L ، پروتئيني غشايي و يكي از اعضاي خانواده TNF است كه نقش مهمي در انتقال پيام سلولي در ايمني ذاتي و تطبيقي دارد. از آن جايي كه اين پروتئين نقش خود را از طريق تجمع گيرنده در سطح سلول هدف ايفا مي كند، به نظر مي رسد فرم مالتي مري آن بتواند اثر قوي تري نسبت به فرم طبيعي ترايمري ايجاد كند. بر اين اساس در اين مطالعه كلونينگ و بيان فرم كايمري و دودكامري CD40L محلول، از طريق پروتئين خود مالتي مر شونده سورفاكتانت پروتئين (SP-D) D، در رده سلولي HEK293 مورد بررسي قرار گرفت. مواد و روش ها: مطالعه انجام شده از نوع تجربي بود. پروتئين SPD-CD40L به صورت in silico طراحي و در پلاسميد pcDNA3.1(+) همسانه سازي شد. سلول هاي HEK293 به عنوان ميزبان بياني مورد استفاده قرار گرفته و ترانسفكت شدند. بيان CD40L نوتركيب در سطح RNA به وسيله RT-PCR بررسي شد. پس از تخليص پروتئين نوتركيب با روش كروماتوگرافي تمايلي، وزن مولكولي آن توسط SDS-PAGE تعيين گرديد. به منظور بررسي اختصاصيت پروتئين نيز از روش هاي ELISA وDot Blot استفاده شد. يافته ها: نتايج به دست آمده نشان دهنده ترانسفكشن سلول هاي HEK293 و بيان پروتئين نوتركيب پس از 24 و 48 ساعت از زمان ترانسفكشن بود. هم چنين نتايج حاصل از روش ELISA و Dot Blot بيانگر اختصاصيت پروتئين كايمري SPD-CD40L بود. نتيجه گيري: پروتئين كايمري SPD-CD40L از طريق وكتور بياني pcDNA3.1(+) در رده سلولي يوكاريوتي HEK293 به طور موفقيت آميز بيان شد و وزن مولكولي پروتئين 4-ترايمري(دودكامري) با مقدار مورد انتظار تطابق داشت.

Background and Objectives: CD40L is a membrane protein and a member of the tumor necrosis factor super family (TNFSF) that plays an important role in transferring cell signaling in innate and adaptive immunity. Since this protein plays its role through clustering the receptors on the target cell surface، it seems that the multimeric form of this molecule can have a stronger effect than the natural trimeric form. So in this study we describe cloning and expression of dodecameric soluble CD40L through self multimerizing protein، surfactant protein D (SP-D)، in the HEK293 cell line. Materials and Methods: In this experimental study، the SPD-CD40L was designed in silico and cloned in pcDNA3.1(+) plasmid. HEK293 cells were transfected and used as the expression host cells. The expression of SPD-CD40L was determined at the RNA level by RT-PCR method. After the purification of the recombinant proteins by affinity chromatography، the molecular weight of the recombinant protein was determined by SDS-PAGE. To evaluate the specificity of protein، ELISA and Dot Blot were used. Results: The results indicated that HEK293 cells were transfected and recombinant protein was expressed 24 and 48 hours after Transfection. Moreover، the results of ELISA and Dot Blot methods represented the specificity of recombinant SPD-CD40L chimeric protein. Conclusions: Chimeric protein SPD-CD40L was expressed successfully by pcDNA3.1(+) in eukaryotic HEK293 cell line and the molecular weight of 4-trimeric (dodecameric) protein was shown to be consistent with the expected amount.