توليد باكتريايي پروتئين نوتركيب كيتيناز از باكتري ترموفيل Paenibacillus ehimensis

Recombinant Chitinase produced from a thermophilic Paenibacillus ehimensis

كيتين، دومين بيوپليمر فراوان در طبيعت بعد از سلولز و جزء اصلي كوتيكول حشرات و پوسته سخت پوستان است و ديواره سلولي بيشتر قارچها و بعضي از جلبكها و نيز نماتدها را تشكيل مي‌دهد. مقادير زيادي كيتين به شكل باقيمانده تجزيه ناپذير بدن بسياري از جانداران وارد طبيعت مي‌شود كه باعث آلودگي محيط زيست مي‌گردد. مي‌توان پس از تجزيه اين پلي ساكاريد با آنزيم كيتيناز از آن در جنبه‌هاي مختلف زندگي بهره جست. كيتينازها يكي از آنزيم هايي هستند كه نقش تجزيه كيتين نامحلول را بر عهده دارند. برخي از باكتري ها كيتيناز را براي هضم كيتين توليد مي‌كنند. در اين تحقيق ژن كيتيناز ترموفيل با شماره دسترسي JQ675723 از جدايه باكتريايي Paenibacillus sp. A01 جداسازي و پس از همسانه‌سازي در pET26b به باكتري اشرشيا كلي براي توليد پروتئين نوتركيب منتقل شد. آنزيم هترولوگ توليدي توسط ستون ميل تركيبي نيكل- سفاروز خالص گرديد؛ آنزيم توليدي نشان داد كه در حضور كيتين كلوييدي و پس از افزودن 3 و5-دي نيترو ساليسليك اسيد در 530 نانومتر و در دماي C° 60 داراي فعاليت هيدرولازي است. دماي بالا، پتانسيل كاربردي شدن آن در صنعت را خاطر نشان مي‌سازد. همچنين توالي نوكلئوتيدي به‌دست‌آمده براي ژن كتيناز به‌صورت تئوري مورد مطالعه قرار گرفت كه تشابه زيادي را به كيتينازهاي دسته‌بندي شده در خانواده 18 گليكوزيل هيدرولازها نشان داد. بررسي توالي آمينواسيدي آنزيم كيتيناز به‌ترتيب از ناحيه آميني به سمت ناحيه كربوكسيل وجود سه دُمين كاتاليتيكي گليكوزيل هيدرولاز 18، شبه فيبرونكتين و متصل‌شونده به كيتين را مشخص نمود.

Chitin is the second most abundant organic polymer in nature after cellulose and it is the main part of Insects cuticle and crustaceans and includes in cell wall of most fungus and some algae and nematodes. Huge amounts of chitin residual are being produced by organisms that enter to the nature as natural pollutants. However, this polysaccharide has immense application in different aspects of our daily life once becomes digested via chitinases. Chitinase is one of the enzymes that responsible for disintegrating chitin. Some of bacteria produce chitinase for digesting chitin. Here, a thermophilic chitinase gene (JQ675723) obtained from a Paenibacillus ehimensis isolate. The gene was cloned in pET26b and transformed into E. coli to heterologously produce the enzyme. The recombinant protein was isolated via affinity chromatography using Ni-NTA column. The enzyme demonstrated to have hydrolytic activity in the presence of chitin and by addition of 3, 5-dinitrosalicylic acid at 530 nm. Moreover high temperature showed industrial potential. Its nucleotide sequence had high similarity to Glycoside hydrolase family 18. Amino acid sequence from amino to carboxyl determined glycosyl hydrolase domain, fibronectin like domain and chitin binding domain.