بهينه كردن انتقال ژن به واسطه اگروباكتريوم در گياه دارويي زنيان با استفاده از ژن fld

Optimization of Agrobacterium-mediated gene transformation in Ajowan medicinal plant (Trachyspermum ammi L.) using fld gene

به منظور بهينه كردن شرايط انتقال ژن به گياه دارويي زنيان عوامل مختلف شامل رقت آگروباكتريوم، سويه آگروباكتريوم، نوع آنتي بيوتيك كشنده آگروباكتريوم، غلظت استوسرينگون و مدت زمان تلقيح بر روي تعداد گياهان باززا شده با استفاده ازسازه ژني p6U-Ubi-FVT داراي ژن انتخابيHPT و ژن fld بررسي شد. غلظت 20 ميلي گرم در ليتر هيگرومايسين براي غربالگري سلول هاي تراريخت و جلوگيري از توليد كالوس در سلول هاي غير تراريخت بهترين غلظت تشخيص داده شد. اثر متقابل سه عامل تراكم سلولي آگروباكتريوم، سويه آگروباكتريوم و نوع آنتي بيوتيك كشنده آگروباكتريوم بر تعداد گياهان باززا شده در سطح احتمال يك درصد معني دار بود و رقت 0/6-0/8 آگروباكتريوم × سويه GV3101 آگروباكتريوم × غلظت 160 ميلي گرم در ليتر آنتي بيوتيك كشنده تيمنتين اثر بازدارنده كمتري بر تعداد گياهان باززا شده داشتند. بيشترين تعداد گياهان باززا شده مقاوم به آنتي بيوتيك هيگرومايسين مربوط به غلظت 254/8 ميكرومولار در ليتر استوسرينگون بود. گياهان باززا شده بيشتري در مدت زمان تلقيح 30 دقيقه نسبت به زمان هاي تلقيح 20 دقيقه و 1 دقيقه حاصل شد همچنين تفاوت آماري معني داري بين ميانگين تعداد گياهان باززا شده حاصل از 20 دقيقه و 30 دقيقه زمان تلقيح مشاهده نشد. بررسي حضور ژن مورد نظر با استفاده از واكنش زنجيره اي پلي مراز روي گياهان باززا شده انجام شد. نتايج وجود حداقل يك نسخه از ژن هدف را در ژنوم گياهان تائيد كرد. برتري گياهان تراريخت نسبت به گياهان غيرتراريخت در تحمل به تنش اسمزي 0/3- مگاپاسكال توسط آزمون زيست سنجي تحمل به تنش اسمزي تاييد گرديد.

To optimize gene transformation condition in ajowan medicinal plant effect of individual parameters such as optical density of Agrobacterium cell culture, Agrobacterum strain, type of antibiotic to elimination of Agrobacterium, acetosyringone concentration and inoculation duration was investigated using p6U-Ubi-FVT1 plasmid contain HPT gene as selectable marker and fld gene. 20 mg/L of hygromaycin was identified as minimum concentration of this selectable agent to prevent of callus induction in non-transgenic cells of ajowan. Interaction effect of optical density of Agrobacterium, Agrobacterium strain and type of Agrobacterium killing antibiotic on number of regenerated plant was significant at 1% probability level and less inhibitory effect on regenerated plant was related to OD600=0.6-0.8×GV3101 Agrobacterium starin×160 mg/L of timentin antibiotic. More regenerated plant resistance to hygromaycin was achieved by 254.8 μm/L of acetosyringone. More regenerated plant was achieved from 30 minutes inoculation duration than 1 and 20 minutes inoculation duration, nonetheless there was no statistically significant difference between means of regenerated plant from 20 and 30 minutes inoculation duration. The presence of the target gene was evaluated using PCR analysis on regenerated plants. Results of PCR analysis confirm entity of at least one copy of the target gene on plants genome. The superiority of transgenic plants against non-transformed plants for tolerance to -0.3 Mpa osmotic stress was proved through osmotic stress tolerance bioassay.