تشخيص و افتراق سريع فاسيولا هپاتيكا و فاسيولا ژيگانتيكا با استفاده از روش loop-mediated Isothermal Amplification

Rapid Detection and Differentiation of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica by Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay

سابقه و هدف: فاسيولا هپاتيكا و فاسيولا ژيگانتيكا فلوك هاي كبدي شايعي بوده كه روي انسان ها و دام ها در تمام نقاط جهان اثرگذار هستند. در مطالعه حاضر ما تكنيك سريع loop-mediated isothermal amplification (LAMP) را در تشخيص و افتراق گونه هاي فاسيولا ارزيابي نموديم. مواد و روش ها: تعداد 50 كرم فاسيولا از كبد گاو و گوسفند كشتارگاه هاي استان مازندران جداسازي شدند. تعداد 8 پرايمر جهت تكثير ناحيه ژني 28S ribosomal RNA براي واكنش LAMP براي گونه هاي فاسيولا طراحي گرديد. واكنش LAMP در حجم µI 20 تحت شرايط تك دمايي در0C 60 به مدت 90 دقيقه انجام گرفت. نتايج تكثير با ديدن رسوب با استفاده از چشم غير مسلح، استفاده از رنگ فلوئورسانس و ژل الكتروفورز بررسي شد. اختصاصيت روش LAMP براي فاسيولا با استفاده از DNA انگل هاي ديكروسليوم دندريتيكم، تريكواسترونژيلوس كالابريفورميس و اكينوكوكوس گرانولوزوس مورد سنجش قرار گرفت. جهت ارزيابي محدوديت تشخيص روش LAMP براي تعيين جنس فاسيولا رقت سريالي از DNA استخراج شده مورد استفاده قرار گرفت. يافته ها: واكنش مثبت LAMP با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي دو گونه تعداد زيادي باند در سايزهاي متفاوت در دماي 0C60 طي مدت 90 دقيقه توليد نمود. شرايط مطلوبي بدون هيچ واكنشي با ساير DNA انگل ها ايجاد گرديد. محدوديت تشخيص روش LAMP تا pg 1 تعيين گرديد. نتايج تشخيص رسوب و رنگ فلوئورسانس با الكتروفورز با ژل آگارز همخواني داشتند. استنتاج: نتايج ما نشان دادند كه روش LAMP يك روش سريع، آسان، كم هزينه با اختصاصيت بالا و معتبر جهت افتراق گونه هاي فاسيولا در مطالعات اپيدميولوژيكي و باليني فاسيولوزيس انساني و دامي در مناطق اندميك مي باشد.

Background and purpose: Fasciola hepatica and Fasciola gigantica are common liver flukes which affect both human and livestock worldwide. In this study we evaluated the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection and discrimination of Fasciola species. Materials and methods: Fifty adults of Fasciola worms were isolated from sheep and cattle liver form abattoirs in Mazandaran province. A total of 8 primer sets for LAMP was designed to amplify the 28S ribosomal RNA gene of Fasciola sp. Conventional LAMP was carried out in a 20μI reaction mixture under isothermal condition at 60°C for 90 minutes. Amplification result was observed by monitoring the turbidity by naked-eye, using fluorescent dye and gel electrophoresis. The specificity of LAMP method for detecting Fasciola sp. was tested by amplification of Dicrocoelium dendriticum, Trichostrongylus colubriformis, and Echinococcus granulosus DNA templates. To evaluate the detection limit of LAMP assay in detecting Fasciola genus, serial dilution of the extracted DNA was used. Results: A positive LAMP reaction by the specific primers of two species produced many bands of different sizes in 600C after 90 min. The optimal assay conditions were established with no reaction with other parasites’ DNA. The detection limit of this LAMP assay was 1 pg DNA/tube. The result of turbidity and fluorescent dye detection were consistent with agarose gel electrophoresis. Conclusion: Our results demonstrated that LAMP is a rapid, cost-effective, highly specific, easy, and reliable method for differentiation of Fasciola sp. in epidemiological and clinical researches on human and domestic animals in endemic regions of fasciolosis.