كلونينگ ، بيان ژن، خالص سازي و تعيين خصوصيات آنزيم الاستاز حاصل از باكتري سودوموناس آئروجينوزا

Cloning, Gene Expression, Purification and Characterization of Elastase from Pseudomonas Aeruginosa

سابقه و هدف: الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجينوزا يك آنزيم مهم در زمينه مطالعات بنيادي بر روي Zn-متالوپروتئازها و نيز بعنوان فاكتور ويرولانس اين باكتري مطرح است. در اين مطالعه ژن مربوط به آنزيم الاستاز از سودوموناس آئروجينوزا (PAE) استخراج و كلون شده و پس از بيان و تخليص، خصوصيات بيوشيميايي آن شامل دما و pH بهينه و نيز فعاليت در حور حلالهاي آلي گليسرول، دي متيل فرماميد (DMF)، متانول، اتانول، اتيلن گلايكول و ايزوپروپانول مورد مطالعه قرار گرفت. مواد و روشها: تاييد گونه باكتري با تستهاي بيوشيميايي شامل سيترات، SIM، MR-VP و TSI انجام شد. DNA ژنومي توسط كيت استخراج و با پرايمر اختصاصي بوسيله PCR ژن الاستاز بدست آمد. كلونينگ در وكتور pET21a(+) با مكان هاي برش HindIII و NdeI صورت گرفت. ترانسفورماسيون به روش شيميايي انجام شد. سپس سلول ها در محيط LB تحت القاي IPTG 1mM قرار گرفته و زمان و شرايط توليد بهينه گرديد. يافته ها: بدنبال تاييد گونه باكتريايي توسط تستهاي بيوشيميايي، DNA ژنومي استخراج شد و سپس ژن PAE به كمك پرايمر اختصاصي توسط PCR جدا شد. ژن الاستاز كه بصورت پري پرو الاستاز كد مي شود، درون وكتور) pET21a(+ كلون و در باكتري E. coli سويه BL21 ترانسفورم گرديد. آناليز سكانس نوكلئوتيدي ژن يك چارچوب خوانش (ORF) داراي 1497 جفت باز كه 497 آمينواسيد را كد مي كند نشان داد. بدنبال القاء به كمك IPTG آنزيم فعال در درون سلول يافت شد. سپس آنزيم توسط كروماتوگرافي تمايلي تخليص گرديد. بررسي خصوصيات آنزيم از قبيل دماي بهينه، pH بهينه و غير فعال سازي حرارتي برگشت ناپذيرانجام شد و همچنين فعاليت آنزيم در حضور حلالهاي آلي بررسي گرديد و بخوبي نشان داده شد كه آنزيم مذكور از مقاومت و فعاليت بسيار بالايي در حلالهاي آلي برخوردار است. نتيجه گيري:آنزيم الاستاز سويه PTCC 1430 در مقايسه با آنزيم سويه PAO1، كه ساختار كريستالي آن تعيين شده، تنها يك تغيير در ناحيه سيگنال را نشان مي دهد. خصوصيات بيوشيميايي نشان مي دهد كه الاستاز يك آنزيم با پايداري زياد در حلال هاي آلي است.

Aim and Background. Pseudomonas Aeruginosa Elastase is an important enzyme in basic studies on Zn-metalloproteases and is also considered as a virulence factor of the bacterium. In the present study, the gene encoding Pseudomonas aeruginosa elastase (PAE) was extracted and clone, Following expression and purification, its biochemical properties including optimal temperature and pH, and also enzymatic activity in the presence of glycerol, dimethylformamide (DMF), methanol, ethanol, ethylene glycol and isopropanol were investigated. Materials and Methods. Bacterial strain was verified by biochemical tests including citrate, SIM, MR-VP and TSI. Genomic DNA was extracted using gene extraction kit and elastase gene was amplified by PCR using two specific primers. Cloning was carried out within pET21a (+) vector with HindIII and NdeI restriction sites and transformation accomplished by chemical method. The cells were cultured under the given optimized conditions, in LB medium with 1mM IPTG. Results. Following the strain verification by biochemical tests, genomic DNA was extracted and PAE encoding gene was isolated using specific primers. Elastase gene, which is encoded as pre-proelastase, was cloned within pET21 a (+) vector and transformed into E.coli strain BL21. Nucleotide sequence analysis shows an open reading frame (ORF) of 1497 nucleotides corresponding to 497 amino acid residues. Following the induction by IPTG, the active enzyme was detected in the soluble fraction. Consequently, the enzyme was purified using affinity chromatography. Enzyme properties such as optimal temperature and pH, irreversible thermo inactivation and organic solvent activity were investigated. Our results clearly indicate that the above mentioned enzyme possesses a noticeable activity and stability within organic media. Conclusion. Elastase from Pseudomonas aeruginosa strain PTCC1430 shows only one amino acid substitution in the signal sequence in comparison with that of strain PAO1 whose crystal structure is solved. Biochemical properties reveal that elastase is a highly stable enzyme in organic solvents.