تشخيص مولكولي سريع بيماري لكه قهوه‌اي مركبات با استفاده از ژن ACT در Alternaria alternata

Rapid Molecular detection of citrus brown spot disease using ACT gene in Alternaria alternata

مقدمه: امروزه استفاده از روش‌هاي شناسايي سريع عوامل بيماري‌زاي گياهي در پيشگيري از شيوع آفت‌ها در كشاورزي اهميت بسياري دارد. بيماري لكه قهوه‌اي از رايج‌ترين بيماري‌هاي مركبات در كشور است كه جدايه‌هاي بيماري‌زاي Alternaria alternataآن را ايجاد مي‌كنند. مواد و روش ها: در پژوهش حاضر، براي نخستين بار روش مولكولي مبتني بر PCR براي تشخيص سريع بيماري لكه قهوه‌اي ارائه شده است. به اين منظور، از باغ‌هاي مركبات كشور نمونه‌گيري و 9 جدايه A. alternata در محيط PDA حاصل شدند. بررسي فعاليت بيماري‌زايي گياهي جدايه‌هاي حاصل روي برگ‌هاي نارنگي نشان داد كه اين جدايه‌ها عامل ايجاد بيماري لكه قهوه‌اي هستند. واكنش PCR براي ژن توكسين اختصاصي ACT روي DNA استخراج‌شده جدايه‌هاي A. alternate همراه با 11 نمونه قارچ غير از A. alternata (شاهد منفي) و 5 نمونه DNA استخراج‌شده از خاك انجام شد. نتايج: نتايج پژوهش حاضر نشان داد كه با پرايمرهاي طراحي‌شده و انجام PCR اختصاصي روي ژن ACT توكسين، A. alternata عامل بيماري لكه قهوه‌اي با‌دقت زيادي نسبت به انواع غيربيماري‌زا شناسايي مي‌شود. نتايج روش PCR آشيانه‌اي نيز تأييدكنندۀ واكنش اوليه و اختصاصي‌بودن واكنش براي A. alternata عامل لكه قهوه‌اي بود. براساس نتايج PCR، براي نمونه شاهد هيچ‌يك از جدايه‌هاي استاندارد قارچي بجز A. alternata باند تكثيري مشاهده نشد. همچنين نمونه DNA استخراج‌شده از خاك باغ‌هاي آلوده حضور توكسين ACT را تأييد كرد. بحث و نتيجه گيري: روش مولكولي ارائه‌شده در اين پژوهش در تشخيص سريع و پيشگيري از عفونت لكه قهوه‌اي در باغ‌هاي مركبات كشور استفاده مي‌شود.

Introduction: Using rapid detection methods is important for detection of plant pathogens and also prevention through spreading pests in agriculture. Citrus brown spot disease caused by pathogenic isolates of Alternaria alternata is a common disease in Iran. Materials and methods: In this study, for the first time a PCR based molecular method was used for rapid diagnosis of brown spot disease. Nine isolates of A. Alternata were isolated in PDA medium from different citrus gardens. The plant pathogenic activity was examined in tangerine leaves for isolates. Results showed that these isolates are the agents of brown spot disease. PCR amplification of specific ACT-toxin gene was performed for DNA extracted from A. alternata isolates, with 11 different fungal isolates as negative controls and 5 DNA samples extracted from soil. Results: Results showed that A. alternata, the causal agent of brown spot disease, can be carefully distinguished from other pathogenic agents by performing PCR amplification with specific primers for ACT toxin gene. Also, the results from Nested-PCR method confirmed the primary reaction and the specificity of A. alternata for brown spot disease. PCR results to control samples of the other standard fungal isolates, showed no amplification band. In addition, PCR with the DNA extracted from contaminated soils confirmed the presence of ACT toxin gene. Discussion and conclusion: Molecular procedure presented here can be used in rapid identification and prevention of brown spot infection in citrus gardens all over the country.