سنجش زيستي و غربال‌گري مولكولي آنزيم پكتيناز در باكتري‌هاي نمك‌دوست جداشده از درياچه‌هاي نمكي ايران

Bioassay and Molecular Screening of Pectinase Enzyme in halophilic bacteria from Salt Lake, Iran

مقدمه: پكتيناز يا آنزيم‌هاي پكتينولاتيكي، كمپلكس آنزيمي شامل سه آنزيم پكتين‌متيل‌استراز (EC.3.1.1.11)، پكتين‌لياز (EC.4.2.2.2) و پلي‌گالاكتوروناز (EC.3.2.1.15) هستند كه باعث تجزيه پكتين موجود در ديواره سلول‌هاي گياهي مي‌شوند. اين آنزيم‌ها مصرف‌هاي صنعتي بسياري دارند كه تعدادي از آنها در شرايط حاد از نظر دما، اسيديته و غظت نمك فعال هستند. در پژوهش حاضر، به بررسي و شناسايي باكتري‌هايي پرداخته شد كه آنزيم پكتيناز را در شرايط حاد غلظت نمك توليد مي‌كنند و سپس ژن مولد اين آنزيم در باكتري‌ها بررسي و شناسايي شد. مواد و روش ها: سويه‌هاي جمع‌آوري‌شده از درياچه‌هاي اروميه، گميشان و اينچهبرون روي محيط حاوي پيش‌ماده پكتين كشت داده شدند و سويه‌هاي مثبت با معرف يديد/يديدپتاسيم و با توجه به هاله‌هاي شفاف ايجادشده انتخاب شدند و سنجش كمي فعاليت آنزيم روي هر سه آنزيم مجموعه پكتينازي به روش اسپكتروفوتومتري انجام شد. براي غربال مولكولي ژن پكتيناز، پرايمرهاي مربوطه طراحي شدند و ژن مدنظر تكثير شد. نتايج: از بين 130 سويه بررسي‌شده، 17 سويه براي اين آنزيم مثبت بودند كه 10 سويه از درياچه گميشان (59 درصد)، 6 سويه از درياچه اينچه‌برون (35 درصد) و 1 سويه از درياچه اروميه (6 درصد) جداسازي شده بود. با توجه به قطر هاله فعاليت آنزيم در آزمون كيفي، ميزان فعاليت هر سه آنزيم پكتينازي در سويه R2S25 از درياچه اينچه‌برون اندازه‌گيري و منحني رشد ترسيم شد. در بررسي مولكولي، تمام سويه‌ها حاوي قطعه ژني مدنظر بودند. بحث و نتيجه گيري: بررسي‌هاي كمي نشان دادند در سويه R2S25، توليد و فعاليت آنزيم‌هاي پكتينازي هم‌زمان با افزايش رشد سويه منتخب در فاز لگاريتمي انجام مي‌شود. بررسي‌هاي مولكولي، حضور ژن اين آنزيم را در جنس‌‌هاي مارتللا، آئروموكروبيوم، پلنوكوكوس، مارينوباكتر، ويرجي‌باسيلوس، كوكوريا و ميكروكوكوس تأييد مي‌كنند.

Introduction: Pectinase or pectinolytic enzymes are complex enzymes which include pectin methyl esterase (EC.3.1.1.11), pectin lyase (EC.4.2.2.2) and polygalacturonase (EC.3.3.1.15) which degrade pectin in the cell wall of plant cells. These enzymes have many industrial applications that some of them are active in extreme condition regarding to temperature, pH and salt concentration. In this study, the bacteria with an ability to produce pectinase enzyme in salty condition were identified and the corresponding gene was analyzed. Materials and methods: Strains from Urmia, Inche boron and Gomeshan Ponds were inoculated in the media containing pectin precursors. By analyzing the clear zones around the colonies based on I2/KI indicator, the positive strains were selected. Quantification of enzyme activity on all three types of pectinase was carried out by spectrophotometry. In order to molecularly screen the bacterium contained pectinase gene, the bacterium genome was amplified using appropriate primers. Results: Seventeen positive strains for pectinase (10 from Gomeshan Lake, 6 from Inche Boron Lake and 1 from where Urmia Lake) were identified among 130 studied samples. According to size of clear zone of enzyme activity in the qualitative test, activity level of all three pectinase enzymes in R2S25 strain of Inche Boron Lake was measured and the growth curve was obtained. Molecular study showed that all strains contain desired gene segment. Discussion and conclusion: Quantitative evaluation showed that production and activity of pectinase enzyme in R2S25 strain increased simultaneously with increasing the growth of selected strain in logarithmic phase. Molecular study also showed that the genuses of Martelella, Aeromocrobium, Planococcus, Marinobacter, Virgibacillus, Kocuria and Micrococcus contain the pectinase gene.