تشخيص ژن اختصاصي eae باكتري انتروپاتوژنيك اشرشياكلي با استفاده از روش نوين PCR-ELISA

Detection of Specific eae Gene from Enteropathogenic Escherichia coli by PCR-ELISA

سابقه و هدف: اشرشياكلي انتروپاتوژنيك از اعضاي خانواده انتروباكترياسه، يكي از شايع‌ترين علل اسهال مزمن در كودكان و نوزادان مي باشد. يكي از روش‌هاي مرسوم جهت تشخيص گونه‌هاي مختلف اشرشياكلي انتروپاتوژنيك، واكنش زنجيره‌اي پليمراز (PCR) مي‌باشد كه به دليل استفاده از ژل الكتروفورز و رنگ‌آميزي با اتيديوم برومايد داراي معايبي از قبيل صرف زمان، محدوديت در تشخيص تعداد نمونه‌ها و هم‌چنين سمي بودن اتيديوم برومايد و ژل آگارز مي‌باشد. اين مطالعه با هدف ارزيابي تكنيك PCR-ELISA جهت تشخيص باكتري اشرشياكلي انتروپاتوژنيك انجام پذيرفت. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه تجربي، كف پليت الايزا استرپتو آويدين بارگذاري گرديد و با استفاده از پروب اختصاصي كه قسمت ابتداي آن بيوتينه شده بود، جهت اتصال به ژن eae تكثير شده با روش PCR استفاده گرديد. بيوتين متصل به پروب به استرپتو آويدين متصل شده، و ژن تكثير يافته نيز به پروب اختصاصي متصل گرديد. در نهايت از آنتي‌بادي ضد ديگوكسيژنين براي شناسايي محصول استفاده شد و واكنش با دستگاه نور سنج اندازه‌گيري گرديد. يافته‌ها: با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي ژن eae اشرشياكلي انتروپاتوژنيك تكثير شد كه نتيجه آن يك قطعه به طول bp999 بود. نتايج حاصل از PCR-ELISA نشان داد كه اين تكنيك هيچ واكنش متقاطعي با باكتري‌هاي هم خانواده خود ندارد و هم‌چنين ميزان حساسيت آن 11 پيكوگرم ارزيابي شد. استنتاج: تكنيك PCR-ELISA روشي حساس و دقيق بوده كه براي شناسايي عوامل بيماري‌زا با استفاده از ژن اختصاصي آن باكتري به كار مي رود. اين تكنيك مي‌تواند جايگزين مناسبي براي تكنيك‌هاي قديمي زمان بر با حساسيت كمتر و هزينه بيش‌تر باشد.

Background and purpose: Enteropathogenic Escherichia coli from Enterobacteriaceae family is one of the most common causes of chronic diarrhea in children and infants. Polymerase Chain Reaction (PCR) method is commonly used for detection of enteropathogenic Escherichia coli species, but there are some disadvantages with this method due to the use of gel electrophoresis and staining with ethidium bromide, including being time consuming, limits on the number of samples, and toxicity of ethidium bromide. The aim of this study was to evaluate the PCR-ELISA technique for detection of enteropathogenic E.coli. Materials and methods: In this study, Streptavidin was loaded in ELISA plate, and a specific Biotinylated probe was used to connect the PCR product. Biotinylated probe was connected to Streptavidin and the amplified gene was attached to the probe. Finally, the digoxigenin antibodies were used to identify the PCR product. The reaction was measured with an ELISA reader. Results: eae of enteropathogenic Escherichia coli was amplified using the gene specific primers which resulted in a fragment of a 999 bp. The results of PCR-ELISA showed that this technique does not cross-react with the bacteria in their families and its sensitivity was 11 pg. Conclusion: PCR-ELISA technique is an accurate and rapid test for detection of infectious agents by the specific gene. PCR-ELISA could be used as an alternative method instead of time-consuming, less sensitive, and expensive techniques.