طراحي، ساخت و بررسي كارآيي دو ناقل بياني گياهي (pBI121GUS-9 و pBI1213+4) با جايگاه‌هاي همسانه‌سازي توسعه يافته

Designing, Construction and Functional Analysis of Two New Plant Expression Vectors (pBI121GUS-9 and pBI1213+4) with Improved Cloning Sites

اكثر ناقلين دوتايي متداول در تراريختي گياهان به واسطه آگروباكتريوم، به‌دليل اندازه بزرگ، داراي تعداد اندكي جايگاه شناسايي منحصر به فرد آنزيم‌هاي برشي شناخته شده و متداول مي‌باشند كه اين موضوع همسانه‌سازي ژن‌هاي موردنظر را در آن‌ها با مشكل مواجه مي­كند. براي رفع اين مشكل ناقل pBI1213+4،با سـه جايگـاه برشي منـحصر به فـرد جديد نسبت به ناقـل pBI121 در پايين‌دست ژن گزارشگر gus (β-glucuronidase) و همچنين ناقل pBI121GUS-9، داراي نه جايگاه منحصر به فرد آنزيم‌هاي برشي بين پيشبر CaMV 35S و خاتمه‌دهنده NOS (با طراحي دو آغازگر يكي در بالا دست و ديگري پايين دست خاتمه‌دهنده NOS و استفاده از آن‌ها در يك واكنش PCR)، ساخته و معرفي شدند. براي بررسي كارآيي ناقلين جديد، هم در مرحله همسانه‌سازي و هم در مرحله انتقال ژن به گياه، ابتدا ژن گزارشگر gus در داخل اين ناقلين همسانه‌سازي و سپس سازه‌هاي نوتركيب حاصل به گياه مدل توتون رقم سامسون منتقل شدند. كارآيي ناقلين جديد، پس از استخراج DNA ژنومي از گياهان تراريخته حاصل از دانهال‌هاي رشد يافته در محيط‌كشت انتخابي، ابتدا با انجام PCR جهت تأييد تلفيق تراژن و سپس آزمون سنجش فعاليت GUS با استفاده از روش هيستوشيميايي براي تأييد بيان مؤثر ژن منتقل شده، ارزيابي شد. آناليزهاي مولكولي، حضور تراژن و بيان آن را در گياهان تراريخته تأييد كردند. با تأييد كارآيي ناقلين pBI121GUS-9 و pBI1213+4در انتقال ژن گزارشگر و بيان مؤثر آن، مي‌توان از آن‌ها براي انتقال ژن‌هاي تجاري به گياهان استراتژيك استفاده كرد.

Most popular binary vectors used in plant transformation via Agrobacterium have limeted common restriction recognition sites due to large vector size which has caused difficulties in cloning of target genes. To overcome this problem, new plant expression vectors including pBI1213+4 with three additional recognition sites downstream of gus gene and pBI121GUS-9 with nine recognition sites between CaMV 35S and Nos terminator (by using two primers designed upstream and downstream of Nos terminator in a PCR reaction) were constructed and identified. To analyze the efficiency of new vectors both in cloning and transformation steps, gus reporter gene was cloned and the new recombinant constructs were transferred to model plant Nicotiana tabbacum L. cv. Samsun via Agrobacterium tumefaciens (LBA4404). DNA was extracted from putative transgenic seedlings, which were regenerated on selective media and analyzed by PCR method. GUS assay confirmed the expression of the transgene in leaves of transgenic seedlings. After verification of the pBI1213+4 and pBI121GUS-9 in transformation and expression of the reporter gene, these vectors can be used for transformation of strategic plants with commercial transgenes.