همسانه سازي، بهينه سازي شرايط بيان و تخليص دمين كاتاليتكي توكسين آدنيلات سيكلاز بوردتلا پرتوسيس از يك سويه بومي ايران

Cloning and optimization of expression and purification of the catalytic domain of adenylate cyclase toxin from an Iranian strain of Bordetella pertussis

زمينه و هدف: توكسين آدنيلات سيكلاز (Adenylate cyclas Toxin= ACT) يكي از فاكتور هاي ويرولانس ترشحي و ايمونوژنيك بوردتلا پرتوسيس است كه داراي يك دمين كاتاليزوري با 400 اسيد آمينه، به نام AC، در ناحيه N- ترمينال خود مي باشد. اين دمين با تحريك غير قابل بازگشت cAMP در سلول يوكاريوت نقش مهمي در ايجاد بيماري سياه سرفه ايفا مي كند و به عنوان يك ابزار زيست شناسي سلولي بوده و در داروهاي ضد سرطاني نيز مورد استفاده قرار گرفته است؛ لذا هدف از اين مطالعه، دستيابي به بيان بالايي از ناحيه AC به منظور بررسي خواص آنتي ژنيك آن در جهت استفاده از آن در واكسن، ادجونت و يا تهيه ي كيت هاي تشخيصي مي باشد. روش بررسي: در اين مطالعه تجربي، قطعه AC، توسط واكنش PCR تكثير و در وكتور pET28a كلون و در باكتري E.coli BL21(DE3)، بيان و پس از بهينه سازي شرايط بيان، آناليز پروتئين توسط ژل SDS PAGE و وسترن بلات انجام و سپس تخليص آن بر روي ستون كروماتوگرافي (NI-NTA) صورت پذيرفت. يافته ها: قطعه AC با موفقيت در وكتور بياني pET28a كلون شده و تحت سيستم بياني القا شونده توسط IPTG با غلظت 5/0 ميلي مولار، پس از 4 ساعت در دماي 37 درجه مي تواند قابليت حداكثر بيان با بازدهي 25 ميلي گرم بر ليتر و خلوص 95% را داشته باشد. نتيجه گيري: اين مطالعه نشان داد با القاي تنها 5/0 ميلي مولار IPTG، مي توان بيان بالاي دمين كاتاليزوري پروتئين ACT، با حداكثر ميزان خلوص را دارا بود كه اين ميزان براي اكثر كاربردهاي تحقيقي و تشخيصي مناسب است.

Background and aims: Adenylate cyclase toxin is one of the immunogenic virulence factors secreted by Bordetella pertussis, that consists of catalytic domain corresponding to the 400 N-terminal residues called AC. This domain can stimulate cAMP synthesis in eukaryotic cells, and it has an important role in development of pertussis. It also can be used as a cell biology tool and in anti-cancer drugs. The aim of this study was to achieve high expression of the antigenic properties of the AC to evaluate its use in vaccines, adjuvant or the provision of diagnostic kits. Methods: In this experimental study, AC domain amplified by PCR reaction, and cloned into pET28a vector and expressed in the E. coli BL21 (DE3) host. After the optimization of expression, protein analysis by SDS PAGE gel and Western blot analysis were performed. Purification was carried out on column chromatography (NI-NTA). Results: AC fragment was cloned successfully into a pET28a vector and under expression system with a concentration of 0.5 mM IPTG induction after 4 hours at 37 °C, AC can be expressed as a function of maximum yields 25mg/L and 95% purity. Conclusion: This study showed that the induction of expression using only 0.5 mM IPTG can result in the over expression of the catalytic domain of protein ACT with maximum purity. This amount is appropriate for many applications, including research and diagnosis.