بهينه سازي آزمون كامت قليايي براي مطالعه DNA سلول هاي منفرد كبدي در ماهي سفيد درياي خزر (Rutilus frisii kutum)

Optimization of single-cell gel electrophoresis (SCGE) method for study of liver single cell DNA in Caspian kutum (Rutilus frisii kutum)

الكتروفورز سلول­ هاي منفرد روشي است كه براي سنجش آسيب DNA استفاده مي شود. اين روش به علت سهولت و سرعت بالا نسبت به روش­هاي ديگر مورد توجه قرار گرفته است. در مطالعه حاضر با اعمال برخي از تغييرات، روش مرسوم سنجش كامت قليايي با استفاده از سلول­هاي منفرد كبد ماهي سفيد درياي خزر(Rutilus frisii kutum) بهينه سازي شد. براي اين منظور 10 عدد ماهي انگشت قد با وزن متوسط 1±7 گرم و ميانگين طول كل 2±10 سانتي متر تهيه شد و از بافت كبد آن­ها نمونه برداري شد. نمونه ها تا شروع آزمايش ها در فريزر 80- قرار داده شدند. در بهينه سازي روش مذكور براي دستيابي به سلول­هاي انفرادي مراحل مختلف سانتريفيوژ حذف شد، مدت زمان انجماد ژل روي اسلايد­ها كاهش و مدت زمان حذف ديواره سلولي با بافر ليز كننده افزايش پيدا كرد و در نهايت روشي ساده براي آرشيو لام­ هاي رنگ آميزي شده با اتيديوم برومايد به مدت حداقل دو هفته ارائه شد. نتايج نشان داد علاوه بر كاهش مدت زمان و مواد و وسايل مصرفي، احتمال خطا نيز كاهش يافت. همچنين شاخص­هاي آزمون كامت مانند طول كامت، ارتفاع كامت، طول دنباله، درصد DNA در دنباله و Tail Moment در مقايسه با روش بهينه سازي شده اختلاف معني داري را نشان نداد (p>0/05)

Single-cell gel electrophoresis (SCGE) is a method that used to evaluate DNA damage in single cells. This method due to its great precision and high operating speed, considered than to other methods. The present study was performed to optimize some of the alkaline comet assay steps by using Caspian kutum )Rutilus frisii kutum( liver single cells. Hence, one batch of the fish fingerlings was used for the experiment (n=10, 7±1g) and fish liver tissues were dissected and transferred to freezer (-80C°) until starting the optimizing procedure and other common methods for comet assay tests. In optimization of conventional method for obtain single cells, centrifuging steps were deleted. Also, the solidification of gel on slides decreased and lysing time of cell membrane increased. Finally, a simple way to archive slides stained with ethidium bromide was present for at least two weeks. In addition to reducing experimental time and consumption materials, the optimized method led to lower cell damage and possibility of artificial error. No significant differences were observed between comet indexes, such as comet length (px), comet height (px), tail length (px), DNA% in tail and tail moment, achieved from the optimized and conventional method.